Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Пространственная организация белковой молекулы
Методика изучения вторичной структуры белков и полипептидов
Электронная микроскопия

Определение размера и формы молекулы белка или полипептида прямым наблюдением имеет несомненные преимущества. Так как биополимеры слишком малы, чтобы их можно было наблюдать в обычном микроскопе с видимым светом, то приходится использовать электронный микроскоп, в котором обычный свет заменен пучком электронов, фокусируемым электромагнитными линзами. Очень малая длина волны электронных пучков теоретически должна обеспечить крайне высокую разрешающую способность — порядка 0,005 Å. Однако различные трудности значительно понижают чувствительность метода, и эффективная разрешающая способность для лучших современных электронных микроскопов составляет около 5—10 Å. Этого вполне достаточно, чтобы позволить оценить размеры и формы белковой молекулы или увидеть а-спираль синтетического полипептида.

В отличие от обычного светового микроскопа, в котором контрасты изображения определяются различием показателей преломления разных частей объекта, в электронном микроскопе контрасты изображения зависят от плотности массы объекта. Так как частицы белка и полипептидов сами по себе недостаточно плотны для электронного пучка и потому недостаточно контрастны, часто для повышения контрастности необходимо прибегать к методам импрегнации (например, импрегнации осмием), окраcки или «теневых покрытий». Два последних приема используются наиболее часто.

В качестве красителя, непроницаемого для электронов и избирательно комбинирующегося с белками, часто используют фосфорно-вольфрамовую кислоту. В этом случае часто прибегают к так называемому негативному окрашиванию (избыток краски отмывается неполностью). В результате на темном фоне неотмытой кислоты будут четко видны светлые изображения молекул белка.

Метод «теневых покрытий» заключается в том, что на исследуемые объекты наносится испарением в вакууме тонкий слой металла. Испарение производится под очень малым углом с металлической спирали, удаленной на сравнительно большое расстояние от объекта. На неровностях объекта, обращенных к спирали, откладывается слой металла, который отбрасывает тень на его другую сторону. По длине образующихся теней можно судить о величине всевозможных выступов на поверхности. При исследовании таких препаратов под электронным микроскопом получаются изображения с очень высокой контрастностью, что позволяет значительно повысить разрешение и видимость вплоть до частиц диаметром 40 Å (в случае волокна — до 15 Å).

С помощью этих приемов в последнее время удалось сфотографировать отдельные макромолекулы а-спирали. Такие снимки были получены для полиглютаминовой кислоты, поли-у-бензоилглютамата и других полипептидов. Так, для поли-у-бензоилглютамата на микрофотографиях были получены стержнеобразные частицы размером около 2030 Å. Поскольку полипептиды у-бензоилглютамата имели молекулярный вес порядка 350000 при весе аминокислотного остатка около 220, то такой полипептид состоял примерно из 1500 остатков. Отсюда на долю каждого аминокислотного остатка приходилось около 1,3 Å по оси спирали, что довольно близко к теоретической величине (1,5 Å, согласно модели Полинга — Кори) При использовании растворителей, расплавляющих а-спирали, на микрофотографиях были обнаружены картины беспорядочных комочков. При исследовании водорастворимых полипептидов с ионогенными боковыми группами (полиглютаминовая кислота или полилизин) можно наблюдать и процесс плавления а-спирали при ионизации боковых групп. Помимо исследования полипептидов метод электронной микроскопии широко применяется для определения размеров и формы вирусов и таких фибриллярных белков, как коллаген и фибрин. Однако вследствие особенностей техники электронной микроскопии нельзя исследовать белки в их естественном гидратированном состоянии. В то же время при высушивании белков возможны артефакты из-за агрегации или фрагментации молекул биополимеров. И, наконец, этот метод, как правило, затруднительно использовать для изучения биополимеров с молекулярным весом менее 10⁵.

Таблица 4 Степень спирализации различных белков (в %)

При рассмотрении вышеизложенных методов становится очевидным, что каждый из них имеет те или иные недостатки. Так, измерение оптической активности еще не дает нам строгих доказательств существования а-спиралей, поглощение света при 190 ммк боковыми радикалами снижает точность ультрафиолетовой спектроскопии, при высушивании образцов для электронной микроскопии возникают различные артефакты и т. д. Все это, естественно, заставляет относиться с известной осторожностью к данным, получаемым каким-либо одним методом, и требует применения нескольких независимых приемов при изучении вторичной структуры белка или полипептида. Для ряда белков результаты, достигнутые с помощью различных методов, часто хорошо совпадают, тогда как в некоторых случаях они весьма противоречивы (табл. 4). Особенно четко это видно на примере рибонуклеазы.

Но несмотря на те или иные недостатки каждого метода, все они находят широкое применение при изучении вторичной структуры белков и полипептидов. Относительная простота этих методов, возможность применения ряда из них для оценки степени спирализации белка в растворе и для оценки типа вторичной структуры делают их незаменимыми источниками информации о строении большинства белков.