Основы биохимии - Филиппович Ю. Б. 1999

Белки
Структура белковой молекулы

Среди большого числа разнообразных гипотез лишь одна выдержала испытание временем — это полипептидная теория строения белковой молекулы, впервые предложенная Э. Фишером (1902) на базе выдвинутых А. Я. Данилев­ским идей о роли —СО—NН-связей в строении белка. Согласно этой теории белковые молекулы представляют собой гигантские полипептиды, по­строенные из нескольких десятков, а иногда и сотен остатков постоянно встречающихся в составе белков аминокислот (см. табл. 6).

Рис. 22. Биологически активные пептиды

Расшифровку сокращений см. в табл. 4. Цифры около названий аминокислотных остатков обозначают их местоположение в молекуле, считая от N-конца к С-концу пептида. Стрелки начинаются от аминокислот, участвующих в образовании пептидной связи СООН-группами. Соседние остатки цистеина в циклах связаны дисульфидными мостиками. Группа NH₂, заключенная в скобки, обозначает амидную группу. Подразумевается, что аминокислотные остатки соединены пептидными связями. Окситоцин и вазопрессин —гормоны задней доли гипофиза. Поступая в кровь, первый из них стимулирует сокращение мышечных волокон, расположенных вокруг альвеол молочных желез и мышц матки, второй — действует главным образом на гладкие мышцы кровеносных сосудов и участвует в регуляции водного баланса организма на уровне почек. Фаллоидин — ядовитое начало мухомора, вызывающее в ничтожных концентрациях гибель организма вследствие выхода ферментов в К⁺ из клеток; связь между остатками цистеина н триптофана в молекуле фаллоидина образована за счет взаимодействия сульфгидрильной группы и пир­рольного кольца их радикалов. Грамицидин — антибиотик, действующий на многие грамположительные бактерии (пневмококки, стрептококки, стафилококки и др.), изменяет проницаемость биологических мембран для низкомолекулярных соединений и вызы­вает гибель клеток. Тиролиберин — гормон, синтезирующийся в гипоталамусе и обеспечивающий высвобождение (отсюда его другое название — рилизинг-фактор), в возможно, и усиление биосинтеза в гипофизе другого гормона — тиротропина, который, в свою очередь, контролирует деятельность щитовидной железы и образование в ней гормона —тироксина; указанная иерархия В регуляции биосинтеза гормонов является ярким примером участия пептидов в регуляции обмена веществ. Meт-энкефалин — пентапетид, возникающий в нервной ткани и изменяющий (ослабляющий) болевые ощущения. Он связывается с рецепторами, на которые воздействуют наркотики, например морфин, и представляет собой эндогенное вещество психотропного действия. Соматостатин — пептид, тормозящий освобождение из передней доли гипофиза синтезируемого там гормона роста — сомато­тропного гормона. Антаманид — циклический декапептид, образующий с Na⁺, Са²⁺ и некоторыми другими катионами комплексы, которые являются прообразами структур, ответственных за перепое ионов через биологические мембраны

О том, что белковые молекулы построены именно таким образом, свиде­тельствуют следующие факты:

1. В нативных белках удается обнаружить очень небольшое число свобод­ных NH₂. и СООН-групп, так как концевые аминокислоты составляют нич­тожную долю огромной полипептидной цепи белка.

2. При гидролизе белков идет постепенное высвобождение NH₂ и СООН-групп в строгом соотношении 1:1, т. е. происходит распад пептидных—СО—NH-связей.

3. При взаимодействии биурета H₂N—СО—NH—СО—NH₂ с растворами щелочи и медного купороса развивается сине-фиолетовое окрашивание (реак­ция на наличие —СО—NH-связей); все белки дают яркую биуретовую реак­цию, т. е. в их молекулах действительно есть большое число пептидных связей.

4. Полипептидная природа ряда белков доказана химическим синтезом.

5. При рентгеноструктурном анализе строения белков удается наблюдать непрерывную полипептидную цепь с характерным для исследуемого белка расположением в ней аминокислотных остатков.

6. Методы, используемые для определения чередования аминокислотных остатков в белках (см. ниже), однозначно свидетельствуют о последователь­ном (в ряде случаев — выборочном, селективном) расщеплении пептидных связей в составе именно полипептидных цепей.

Характерной особенностью строения полипептидной цепи является то, что атомы С и N в ее хребте, составленном из монотонно повторяющих­ся —СО—СН—NH-фрагментов, располагаются приблизительно в одной плос­кости, в то время как атомы и радикалы > CHR-группировок направлены к этой плоскости под углом 109°28'. При этом в соседних аминокислотных остатках расположение атомов Н и радикалов противоположно. Сказанное ясно из рассмотрения рис. 23, А и структуры фрагмента полипептидной цепи молекулы инсулина (см. с. 54).

Другая особенность строения полипептидной цепи заключается в особом характере —СО—NH-связи. Расстояние между атомами С и N в пептидной связи 0,1325 нм, т. е. меньше нормального расстояния между а-углеродным атомом и атомом N той же цепи, равного 0,146 нм. Вместе с тем оно превышает расстояние между атомами С и N, соединенными двойной связью (0,127 нм). Таким образом, связь С и N в —СО—NH-группировке может рассматриваться как промежуточная между простой и двойной вследствие сопряжения π-электронов карбонильной группы со свободными электронами атома азота. Это определенным образом сказывается на свойствах полипеп­тидов и белков: по месту пептидных связей легко осуществляется таутомерная перегруппировка, приводящая к образованию енольной формы пептидной связи, отличающейся повышенной реакционной способностью:

Третья своеобразная черта строения пептидной связи состоит в том, что все входящие в ее состав атомы располагаются в одной плоскости (рис. 23, В): такая конфигурация называется планарной (плоской) и поддерживается дело­кализацией электронной плотности двойной связи карбонильной группы на Связь между углеродом и азотом (рис. 23, Б).

Наконец, четвертое свойство полипептидной цепи заключается в том, что ее остов, построенный из —NH—СН—СО-фрагментов, окружен разнообраз­ными по своей химической природе боковыми цепями, что можно видеть при рассмотрении структуры фрагмента молекулы инсулина (см. с. 550.

Боковые цепи функционально многолики. Они представлены (см. табл. 4 и рис. 18) жирными (ала, вал, лей, иле), ароматическими (фен) и гетероцикличе­скими (про, три, гис) радикалами. Многие из них несут свободные аминные (лиз, арг), карбоксильные (асп и глу), гидроксильные и фенольные (сер, тре, тир), тиольные (цис), амидные (асн, глн) и другие функциональные группы. Взаимодействуя с окружающими молекулами растворителя (вода), свободные NH₂. и СООН-группы ионизируются, образуя катионные и анионные центры молекулы белка. В зависимости от их соотношения белковая молекула полу­чает суммарный положительный или отрицательный заряд, а также характе­ризуется тем или иным значением pH среды при достижении изоэлектрической точки белка. Число и соотношение катионных, анионных и иных групп в неко­торых белках приведены в табл. 7.

Таблица 7 Распределение групп в белках (число груш в одной молекуле)

Резкое преобладание в молекуле пепсина карбоксильных групп над амин­ными требует высокой концентрации водородных ионов для перевода его в изоэлектрическое состояние, в то время как почти равное число тех или других в молекуле миоглобина сопровождается изоэлектрической точкой, близкой к pH нейтральной среды (см. табл. 3).

Строение радикалов оказывает большое влияние на многие другие свойст­ва белков и особенно на пространственную конфигурацию полипептидной цепи: образующиеся солевые, эфирные, дисульфидные и другие мостики за­крепляют относительное расположение участков цепи при формировании третичной структуры белка (см. ниже). Радикалы также в основном определя­ют круг химических реакций, свойственных белковым телам, и оказывают наряду с другими факторами существенное влияние на функциональную ак­тивность белков.

Долгое время представления о структуре белковой молекулы ограничива­лись признанием полипептидной цепи как ее основы без какой-либо детализа­ции закономерностей чередования аминокислотных остатков или конфигура­ции цепи. Лишь разработка новых методов определения последовательности расположения остатков аминокислот в полипептидной цепи и усовершенство­вание рентгеноструктурного анализа белковых кристаллов позволили продви­нуться вперед в понимании как первой (закономерности чередования амино­кислот), так и второй (закономерности в конфигурации полипептидной цепи) проблем.

В настоящее время в достаточной мере разработан вопрос о первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурах белковой молекулы. Пред­ставление о четырех уровнях структуры белковой молекулы впервые выдвинуто Линдерстром-Лангом, исходя из методических соображений. Естественно, что все перечисленные уровни структуры сосуществуют в белковой молекуле и их уникальное сочетание в каждом конкретном случае определяет общее строение белковой частицы.

Рис. 23. Стандартные значения межатомных расстояний (в нанометрах) и ва­лентных углов в полипептидной цепи (А) и делокализация электронной плот­ности по пептидному звену (Б), приводящая к стабилизации его плоской конфигурации (В и Г)

Фрагмент полипептидной цепи молекулы инсулина (1-9-й аминокислотные остатки цепи Б)

Первичная структура белка. Под первичной структурой белка понимают последовательность в расположении аминокислотных остатков в одной или нескольких полипептидных цепях, составляющих молекулу белка. Зная пер­вичную структуру белка, можно написать его полную химическую формулу.

Схема 1. Последовательность операций при установлении первичной структуры белка

Учитывая, что в составе белковой молекулы содержится как минимум несколь­ко десятков аминокислотных остатков, определение местоположения каждого из них составляет весьма сложную задачу. Ее решение может быть достигнуто в результате осуществления ряда операций, приведенных на схеме 1.

Раскрытие дисульфидных связей в молекуле белка (схема 1) необходимо, с одной стороны, для обеспечения последующего этапа фрагментирования полипептидной цепи белка и, с другой — для превращения всех остатков цис в белке в остатки цистеиновой кислоты, не разрушающейся при дальнейшем анализе:

Селективный гидролиз денатурированного белка ведут протеолитическими ферментами, чаще всего либо трипсином (по остаткам арг и лиз), либо химотрипсином (по остаткам три, фен и тир):

Можно деструктировать белок и химическими агентами, например, бромцианом — по остаткам мет, 2,4-динитрофторбензолом — по остаткам цис, N-бромсукцинимидом — по остаткам тир или три и т. п.:

В результате получают два-три различных набора пептидов изучаемого белка, что обеспечивает воссоздание его первичной структуры на заверша­ющем этапе работы.

Фракционирование пептидов является многоступенчатым, длительным, трудоемким, но необходимым элементом схемы определения первичной структуры белка. Для этой цели используют преимущественно высоковольт­ный (до 10000 В) электрофорез на бумаге, особенно на заключительном этапе фракционирования, и хроматографию различных видов, в том числе ионооб­менную и распределительную.    

Определение последовательности аминокислотных остатков в индивидуаль­ных пептидах — наиболее ответственная процедура при установлении первичной структуры белков. В настоящее время эту работу ведут преимущественно либо фенилизотиоцианатным методом Эдмана, либо масс-спектрометрическим.

Фенилизотиоцианатный метод Эдмана (1950) реализуется в специально со­зданном для этой цели приборе, получившем название секвенатор (от англ. sequence — последовательность). Принципиальная схема устройства твердо­фазного секвенатора й принцип его работы показаны на рис. 24. В современ­ных моделях секвенатора удается определить чередование аминокислотных остатков не только в коротких пептидах, но и непосредственно в полипептид­ных цепях белка, проходя до 70 аминокислотных звеньев в его молекуле.

Рис. 24. Схема устройства секвенатора (пояснения в тексте)

Метод Эдмана сводится к обработке фенилизотиоцианатом белка или пептида (рис. 25), присоединенного через С-концевую аминокислоту к инерт­ному носителю (полистиролу или пористому стеклу) в колонке секвенатоpa (реакция сочетания). После промывки колонки растворителями (метанол, дихлорэтан) образовавшийся фенилтиокарбамилпептид подвергают воз­действию безводной трифторуксусной кислоты, в результате чего высво­бождается анилинотиазолинон и в его составе N-концевая аминокислота (реакция отщепления), а укороченный на один аминокислотный остаток пептид или белок остается связанным с носителем. Анилинотиазолинон поступает в коллектор фракций и, далее, после превращения в водной среде в фенилтиогидантоин (реакция конверсии) — на хроматографическое определение отщепившейся N-концевой аминокислоты. Будучи промыт растворителями, секвенатор готов к следующему циклу работы в авто­матическом режиме.

Рис. 25. Химические реакции, протекающие при секвенировании пептидов и белков (поясне­ния в тексте)

Рис. 26. Принципиальная схема уст­ройства масс-спектрометра:

1 — инжекторное устройство для ввода образца; 2 — ионизационная камера; 3 в 5 — система фильтров; 4 — электромагнит; 6 — детектор; 7 — привод само­писца; 8 — лента самописца

Масс-спектрометрический метод определения первичной структуры пепти­дов, приложимый пока лишь к сравнительно коротким, примерно, 10-членным пептидам, состоит в фрагментации аминокислотного типа эфиров ацилпеп­тидов с последующим разделением полученных при этом положительно заря­женных фрагментов. Фрагментацию осуществляют воздействием электронно­го удара, а разделение фрагментов — в масс-спектрометре (рис. 26). В резуль­тате получают масс-спектр фрагментов пептида (рис. 27), расшифровывая который, делают заключение о первичной структуре пептида. Хотя расшифровка масс-спектра фрагментов пептида весьма сложна, однако, исходя из знания аминокислотного состава пептида и используя электронно-вычисли­тельные машины для просчета различных вариантов сочетания аминокислот­ных остатков в пептиде, находят тот вариант структуры, расчетные данные которого совпадают с экспериментальными.

Рис. 27. Масс-спектр метилового эфира N-деканоиллейцилаланилаланилаланина

На рисунке приведены массовые числа, соответствующие аминокислотному типу фрагмен­тации пептида; как ясно из названия исследованного соединение, аминогруппа N-концевой

аминокислоты — лейцина ацилирована и несет деканоильную

группировку, а карбоксильная группа С-концевой аминокислоты — аланина, этерифицирована и несет метильную грушу; именно такое производное пептида фрагментируется по аминокислотному типу, т. е. преимущественно по пептидным связям с образованием фрагментов, характеризующихся соответствующими массовыми числами

Заключительный этап работы при выяснении порядка следования амино­кислотных остатков в белковой молекуле—воссоздание первичной структуры белка на основании данных о последовательности их расположения в пеп­тидах, полученных при селективном гидролизе. Так как избирательное расщепление пептидных связей при исследовании первичной структуры белков ведут не менее чем двумя агентами, обеспечивающими разрыв пептидных связей в разных точках полипептидной цепи, то первичные структуры того и другого набора полученных пептидов неизбежно перекрыва­ются. Это открывает возможность воссоздания первичной структуры белка (рис. 28). Если при посредстве секвенатора удалось выяснить чередование аминокислотных звеньев в фрагментах белковой молекулы значительного размера, то это существенно упрощает процесс воссоздания ее первичной структуры.

Другие методы определения последовательности расположения аминокис­лотных остатков в белковой молекуле основаны главным образом на ис­пользовании ферментов, способных ускорять реакции последовательного от­щепления аминокислот либо с N-, либо с С-конца полипептидной цепи. Однако они не получили еще столь широкого распространения и аппаратурного оформления, как рассмотренные выше. В последние годы ведущее место в выяснении первичной структуры белков занял метод, который условно можно назвать генетическим: он основан на выведении последовательности аминокислот в белковой молекуле исходя из структуры гена, кодирующего биосинтез этого белка. Именно так была расшифрована структура самых длинных полипептидных цепей — фактора VIII свертывания крови (2332 ами­нокислотных остатка) и субъединицы тиреоглобулина (2750 аминокислотных остатков). Нельзя не упомянуть также только что появившиеся сообщения об определении первичной структуры белков методом лазерной фотодиссоциации; учитывая его высочайшую чувствительность (для анализа достаточно 5 нмоль белка при молекулярной массе 50 кДа), он, по-видимому, имеет большое будущее.

Первым белком, первичную структуру которого удалось расшифровать благодаря работам Ф. Сангера и сотр. (1951 —1953), был инсулин быка (за это в 1958 г. Ф. Сангеру была присуждена Нобелевская премия). Инсулин — бе­лок-гормон, регулирующий углеводный обмен. Он синтезируется в поджелу­дочной железе в виде предшественника, структура которого показана на рис. 29. При нарушении биосинтеза инсулина у человека развивается сахарное мочеизнурение, или диабет.

Субъединица инсулина (М = 6000) состоит из 51 аминокислотного остатка, собранных в две полипептидные цепи (А и В), которые соединены двумя дисульфидными мостиками.

Согласно справочнику Л. Крофта на август 1975 г. была выяснена пер­вичная структура 932 соединений пептидной природы, из числа которых не менее 800 — белки. Учитывая, что в последующее время расшифровывали от нескольких десятков до нескольких сотен первичных структур ежегодно (в 1976 г.—76; в 1977 г.—380), список белков с полностью известным чере­дованием аминокислот в их молекулах к январю 1985 г. достиг 2657. В ряде случаев определена первичная структура одного и того же белка, но выде­ленного из разных организмов. Так, первичная структура инсулина, миоглобина и гемоглобина изучена у 20 видов, цитохрома с — у 60, лизоцима — у 10 и т. д. Ниже приведены первичные структуры перечисленных белков, характер­ные для человека:

Рис. 28. Воссоздание первичной группы леггемоглобина по данным о первичной структуре пептидов, полученных при его селективном гидролизе трипсином (Т), химотрипсином (С) и термолизином (Тл) — микробной протеиназой, специфичной к оста­ткам гидрофобных аминокислот, а также при его расщеплении бромцианом CNBr

Леггемоглобин — кислородсвязывающий гемо протеин бобовых растений, играющий важную роль в фиксации молекулярного азота клубеньковыми бактериями. Т—I, Т—2 и т. д.—триптические пептиды; С—1, С—IV и т. д. — химотриптические; Тл—XXX, Тл—XXXI и т. д.— термолизиновые; CNBr — цианобромидные пептиды. Перекрывающиеся зоны стрелок отмечают перекрытия пеп­тидов из разных гидролизатов, а па стыках стрелок расположены точки селективного распада полипептидной цепи. Первичная структура фрагментов, содержащих аминокислотные остатки с 1-го по 24-й и с 29-го по 58-й, определена с помощью секвенатора

Рис. 29. Первичная структура проинсулина быка

С-лептид отщепляется от проинсулина в процессе превращения его в инсулин под воздействием специфического фермента, ускоряющего гидролиз пептидных связей по остаткам аргинина в позициях 31 и 60

В Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина выполнен ана­лиз первичной структуры ß- и ß'-субъединиц ДНК-зависимой РНК-полимеразы — белков, имеющих очень длинные полипептидные цепи, 1342 и 1407 аминокислотных остатков соответственно; аспартатамино-трансферазы из сердца свиньи — 412; леггемоглобина из клубеньков желтого люпина — 153; LIV (лей, иле, вал) — связывающего белка из кишечной палочки — 344; нейро­токсинов из яда среднеазиатской кобры — 72; белков L10 и L25 из рибосом кишечной палочки — 164 и 94 соответственно; а-субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы—329; инсектотоксина из яда среднеазиатского скорпиона— 62; зрительного родопсина — 348; фактора элонгации G—701; у-субъединицы ГТФ-связывающего белка и у-субъединицы цикло-ГМФ-фосфодиэстеразы из сетчатки крупного рогатого скота — 69 и 87 соответственно; С₃₉-белка из мозжечка быка — 341; а- и ß-субъединиц Na⁺, К⁺-АТФазы из почек свиньи — 1016 и 302 аминокислотных остатков соответственно.

В нашей же стране расшифрованы первичные структуры пепсина свиньи — 313 остатков (В. М. Степанов и др.); стурина — 27 (А. Б. Силаев); актиноксан­тина — 107 (П. Решетов); лактогенного гормона —198 (Н. А. Юдаев); полиэдренного белка вируса ядерного полиэдроза — 244 (С. Б. Серебряный и др.); нейротоксина из яда среднеазиатского скорпиона—65 (Е. Гришин и др.); холестерин — гидроксилирующего цитохрома Р-450 из митохондрий коры над­почечников быка — 481 (В. А. Чащин и др.); а- и ß-субъединиц лютеинизирующего гормона из гипофиза кита — 96 и 118 соответственно (В. С. Карасев и др.); кальмодулина из мозга человека — 148 (Ю. Б. Алахов и др.); гуанилспецифичной РНКазы из нескольких видов аспергилла — 102 (С. В. Шляпников и др.); рестриктазы Eco RV из кишечной палочки — 241 (А. А. Баев и сотр.); нейротоксина III из актинии — 48 (Т. А. Зыкова и др.); нейраминидазы, струк­турного белка нуклеопротеина и гемагглютинина вируса гриппа—470, 498 и 566 соответственно (А. Б. Беклемишев и др.); В₄ полипептида глицинина из сои—251 (Е. С. Захарова и др.); гепаторедоксина из митохондрий печени быка—117 (В. Л. Чащин и др.); аспергиллопепсина А-320 (В. И. Остромысловская и др.); фосфорибозиламиноимидазол-сукцино-карбоксамидсинтетазы пекарских дрожжей — 306 (Н. А. Мясников и др.); белка VP1 вируса ящура — 254 (А. М. Онищенко и др.); онкобелка р53 мыши — 390 (П. М. Чумаков и др.); пролактина из гипофиза человека — 204 (Н. П. Мертвецов и др.); инсектоток­сина из яда погребного паука — 35 (Н. Ж. Сагдиев и др.); белка PV2 вируса гриппа — 759 (Н. А. Петров и др.); А- и В-субъединиц токсина шигеллы — 315 и 89 соответственно (А. А. Баев и сотр.); а-субъединицы Na⁺, К⁺-АТФазы из мозга человека (III форма)—1013 (О. И. Макаревич и др.) и ß-субъединицы фосфодиэстеразы цГМФ — 852 (В. М. Липкин и др.) аминокислотных остатка.

Каждый из белков, первичные структуры которых приведены выше (за исключением гемоглобина), представлен одной полипептидной цепью боль­шей или меньшей длины. Чередование аминокислотных остатков в полипеп­тидной цепи индивидуального белка неповторимо и специфично. В некоторых случаях молекулы белков построены из двух или более полипептидных цепей, соединенных друг с другом ковалентными связями. Примером такого рода может служить молекула инсулина (см. рис. 29). В большинстве же своем молекулы белков состоят из нескольких полипептидных цепей, удерживаемых силами слабых взаимодействий.

При рассмотрении первичной структуры белковых тел возникает прин­ципиально важный вопрос: осуществляются ли в белках все потенциально возможные комбинации из аминокислотных остатков, их составляющих, или существуют некоторые сочетания аминокислотных остатков, характерные для многих, а может быть, и для всех белковых тел? Ведь белки и пептиды за счет перестановки аминокислотных остатков в полипептидной цепи мо­гут давать огромное число изомеров:

Понятно, что при увеличении числа аминокислотных остатков в белковой молекуле до нескольких сотен количество возможных изомеров может достигнуть астрономических величин. Однако анализ чередования аминокислот в белках, проведенный в последние годы, привел к открытию ряда закономерностей, позволяющих утверждать, что в белках реализуются далеко не все возможные первичные структуры. Прежде всего, в различных белках, а часто и в одном и том же, встречаются идентичные (тождественные) пептидные группировки. Особая роль в структурном подобии белков принадлежит тождественным трипептидным группировкам, но в некоторых случаях и более обширные фрагменты совпадают по порядку чередования аминокислотных остатков. Так, в 52 рибосомных белках тождественные трипептидные блоки повторяются 657 раз, тетрапептидные — 86, пентапептидные — 11, гексапептидные — 3, гептапептидные — ни одного раза. Вместе с тем в полипептидных цепях есть аналогичные пептидные группировки, отличающиеся друг от друга взаимозаменяемыми аминокислотными остатками, т. е. такими остатками аминокислот, которые близки по строению или биогенети­чески, например: гли—сер, гли—ала, лей—иле, лей—вал, глу—асп и др. Установлено, что в ряде случаев первичные структуры различных белков включают 50% и более тождественных пептидных фрагментов.

Кроме того, значительные совпадения первичной структуры характерны для белков, выполняющих сходные биологические функции. Это показано, например, для семейства ферментов, ускоряющих реакции дегидрирования разнообразных субстрактов, а также для многих гидролаз, у которых последо­вательность аминокислотных остатков вблизи активного центра крайне близка и стандартна. Особенно высоким структурным подобием отличаются белки, выполняющие у разных видов одну и ту же функцию, что наглядно выявляется при сопоставлении первичных структур инсулина (табл. 8), а также цитохромов, гистонов, гипофизарных гормонов и других белков. У цитохромов, выделенных из синезеленых, красных и бурых водорослей, первичные структу­ры совпадают на 48—67%. Таким образом, видовая специфичность первичной структуры гомологичных белков сводится к ограниченному числу аминокис­лотных замен в полипептидной цепи в строго определенных положениях.

Богатейший материал этого рода дали анализы первичной структуры аномальных гемоглобинов человека, где замена всего лишь одной аминокис­лоты в a-, ß-, у- или б-цепи сопровождается возникновением каждый раз нового типа аномального гемоглобина. Таких гемоглобинов известно сейчас более двухсот. Они являются источником заболеваний человека, относящихся к категории молекулярных болезней. Так, например, при замене в ß-цепи гемоглобина человека шестого остатка глу на остаток вал возникает аномаль­ный гемоглобин S. Это приводит к образованию эритроцитов серповидной формы с меньшим временем жизни, результатом чего является тяжелое наследственное заболевание —серповидная анемия.

Таблица 8 Различия в первичных структурах А- и В-цeпей инсулинов разного происхождения

Примечание. В остальных позициях цепей А и В инсулина разного происхождения чередование аминокис­лотных остатков идентично; инсулин трески резко отличается по первичной структуре от инсулинов, перечислен­ных в таблице видов.

Вторичная структура белка. Строго линейная полипептидная цепь присуща крайне ограниченному числу белков. Одним из таких белков является фиброин шелка — белок, выделяемый гусеницами шелкопряда. В силу особых условий формирования шелкового волокна в мощном мускульном прессе гусеницы нитевидные молекулы фиброина, почти лишенные обрамляющих главную полипептидную цепь радикалов, ориентируются вдоль шелкоотделительного протока и плотно упаковываются по ходу шелкового волокна, приобретающе­го на некоторых участках псевдокристаллическое строение. Рентгеноструктур­ный анализ дал возможность выявить в первую очередь именно линейный характер полипептидных цепей в фиброине шелка и, таким образом, в 30-е годы нашего столетия возникло представление о белковой молекуле как полностью вытянутой полипептидной цепи с периодом идентичности в 0,71 нм (подобной той, что изображена на рис. 23).

Однако позднее также рентгенографически было найдено, что даже в фиб­риллярных белках, не говоря уже о глобулярных, очень редко удается обнару­жить полностью растянутые полипептидные цепи. Рентгеновские снимки посто­янно указывали на наличие в белках цепей, каким-то образом сложенных или скрученных, для которых повторяемость расположения структурных элементов составляла 0,54 нм. На основании анализа рентгенограмм растянутых и нор­мальных волокнистых белков, таких, как кератин волоса, В. Астбери и Ф. Белл (1941) впервые предложили модель свертывания полипептидной цепи. Она вполне объясняла наблюдаемый в опытах период идентичности в 0,54 нм и его изменение при растяжении белкового волокна. Эта модель была уже построена с учетом того, что валентные углы и межатомные расстояния, характерные для пептидной связи и ее ближайшего окружения, не должны нарушаться.

Линия на моделирование как средство решения проблемы структуры бел­ковой молекулы была продолжена Л. Полингом и Р. Кори (1949—1951). Они выдвинули критерии условий построения модели, отражающей возможное конформационное состояние полипептидной цепи в белковой молекуле.

Исходя из выдвинутых критериев, Л. Полингом и Р. Кори были построены спирали а- и ß-типа, а Б. Лоу и Р. Бейбуттом — п-спираль.

Так как только характеристика а-спиральной конформации цепи совпадала с величинами, наблюдаемыми при рентгеноструктурном анализе белковых кристаллов, то именно она и была признана Л. Полингом и Р. Кори в качестве одного из структурных элементов, реально существующих в белковых моле­кулах (рис. 30). Сейчас представление о существовании а-конформации поли­пептидной цепи в белках является общепринятым.

Как видно из рисунка, а-спираль характеризуется предельно плотной упа­ковкой скрученной полипептидной цепи, так что все пространство внутри мыслимого цилиндра, в пределах которого идет закручивание, заполнено. На каждый виток правозакрученной а-спирали приходится 3,6 аминокислотных остатков, радикалы которых направлены всегда наружу и немного назад (вверх на модели), т. е. отклонены в сторону начала полипептидной цепи. Правый ход спирали легко установить, если смотреть в торец спирали со стороны N-концевой аминокислоты полипептидной цепи (начало молекулы): на модели ясно видно, что закручивание полипептидной цепи идет по часовой стрелке. Шаг спирали (расстояние между витками) составляет 0,54 нм, а угол подъема витка равен 26°. Период идентичности, т. е. длина отрезка спирали, полностью повторяющегося по ходу ее, составляет 2,7 нм (18 аминокислотных остатков).    

Важнейшую роль в формировании и поддержании а-спиральной конфигу­рации полипептидной цепи играют водородные связи, возникающие между —СО- и —NH-группами хребта полипептидной цепи, расположенными на соседних витках спирали (рис. 30). И хотя энергия этих связей невелика, большое количество их приводит к значительному энергетическому эффекту, в результате чего а-спиральная конфигурация достаточно устойчива и жестка. Предполагают, что я-электроны СО- и NH-группировок полипептидной цепи могут вступать во взаимодействие через водородные связи, осуществляющие контакт соседних витков а-спирали. В результате на спирализованных участ­ках белковой молекулы возникают зоны сопряжения электронов. Они могут служить для передачи энергии возбуждения электронов, что имеет огромное значение для осуществления химических реакций и трансформации одного вида энергии в другой. Таким образом, под вторичной структурой белковой молекулы подразумевают ту или иную конфигурацию, характерную для од­ной или нескольких полипептидных цепей, входящих в состав Молекулы.

Не следует представлять дело так, что в любом белке полипептидная цепь полностью спирализована. Такие случаи очень редки. Видимо, для каждого белка характерна та или иная степень спирализации полипептидной цепи:

Рис. 30. Модели и схема а-спирали

На модели а-спирали (слева) зачернены участии спирали, обращенные к наблюдателю; пунктиром обозначены водородные связи между СО- и NH-группами, расположенными на соседних О участках спирали; атомы водорода показаны в виде маленьких кружочков. На схеме а-спирали (рядом) опушены все радикалы и показан ход хребта полипептидной цепи соответственно таковому в модели. Правее даны изображения а-спирали и π-спирали (крайняя справа) с учетом планарности пептидных связей

Таким образом, в белковых молекулах спирализованные участки полипеп­тидной цепи закономерно чередуются с линейными.

В природных белках существуют лишь правозакрученные а-спиральные конформации полипептидных цепей, что сопряжено с наличием в белковых телах аминокислот только L-ряда (за исключением особых случаев).

Наряду с а-спиральной структурой в белковых молекулах наблюдается также ß-структура. Под последней подразумевают слоистые структуры, образуемые при сочетании участков полипептидной цепи, находящихся в ß-конформации, т. е. в виде линейно построенных пептидных фрагментов. Линейная конформация этих фрагментов удерживается благодаря воз­никновению водородных связей между параллельно идущими и сближенными на расстояние 0,272 нм (соответственно длине водородной связи между СО- и NH-группами) участками полипептидной цепи (рис. 31). Подобные структуры в массовом количестве представлены в волокнистых белках, например в фиброине шелка. Однако и в глобулярных белках ß-структуры присутствуют систематически и часто превалируют над а- структурами.

Возникновение а- и ß-структур в белковой молекуле является следствием того, что аминокислоты и в составе полипептидных цепей сохраняют прису­щую им способность к образованию водородных связей. Таким образом, крайне важное свойство аминокислот — соединяться друг с другом водород­ными связями в процессе образования кристаллических препаратов — реализу­ется в виде а-спиральной конформации или ß-структуры в белковой молекуле. Следовательно, возникновение указанных структур допустимо рассматривать как процесс кристаллизации участков полипептидной цепи в пределах одной и той же белковой молекулы (рис. 32).

Способность к образованию водородных связей, являющихся движущей силой при возникновении а- и ß-структур в белковой молекуле, присуща разным аминокислотам в неодинаковой степени. Среди них вычленяют группу спиралеобразующих аминокислот, куда входят ала, глу, глн, лей, лиз, мет и гис. Если остатки перечисленных аминокислот сконцентрированы в какой-то части полипептидной цепи или превалируют в ее составе, то а-спирализация осуществляется очень гладко. Наоборот, такие аминокислоты, как вал, иле, тре, тир и фен, способствуют образованию ß-слоев полипептидной цепи. Гли, сер, асп, асн и про имеют отношение к преимущественному возникновению неупорядоченных фрагментов в ее составе. Рис. 33 иллюстрирует один из вариантов сосуществования а- и ß-структур в одном и том же белке.

Третичная структура белка. Сведения о чередовании аминокислотных оста­тков в полипептидной цепи (первичная структура) и наличие в белковой молекуле специализированных, слоистых и неупорядоченных ее фрагментов (вторичная структура) еще не дают полного представления ни об объеме, ни о форме, ни тем более о взаимном расположении участков полипептидной цепи по отношению друг к другу. Эти особенности строения белка выявляют при изучении его третичной структуры, под которой понимают общее рас­положение в пространстве составляющих молекулу одной или нескольких поли­пептидных цепей, соединенных ковалентными связями. Эту структуру ранее обозначали как архитектонику белковых молекул.

Решение этой сложнейшей в химии белка проблемы связано с усовершенст­вованием рентгеноструктурного анализа, выразившимся в увеличении раз­решающей способности метода до 0,14 нм. Поскольку межатомные расстоя­ния в молекулах органических соединений составляют 0,1—0,2 нм, столь высокая разрешающая способность дает возможность точно установить рас­положение каждого атома полипептидной цепи в пространстве, т. е. построить исчерпывающую модель белковой молекулы. По разрешающей способности рентгеноструктурный анализ превосходит только метод ядерного магнитного резонанса (0,03—0,09 нм), все более часто применяемый для изучения третич­ной структуры белков. Кроме того, для этой же цели используют электронную микроскопию, круговой дихроизм, дисперсию оптического вращения и ней­тронную кристаллографию, не говоря уже о массовом предсказании третич­ной структуры белков по их первичной структуре при помощи ЭВМ.

Рис. 31. ß-Структура белков:

А — возникновение ß-структуры; пунктиром обозначены водородные связи между СО- и NH-группами латерально расположенных полипептидных цепей; Б — плоский слой, образованный антипараллельно рас­положенными молекулами полиглицина; I — фрагмент объемной модели отдельной молекулы полиглицина: II — слой из объемных моделей молекул полиглицина; В' — ß-слой, составленный из двух фрагментов полипептидной цепи, построенных с учетом планарности пептидных связей

Рис. 32. Модели свертывания полипептидной цепи в а-спираль с образованием системы водородных связей между витками спирали:

А — в виде бумажной ленты с выписанной на ней структурой полипептидной цепи; водородные связи, являющиеся источником взаимодействия, приводящим к спирализации, показаны пунктиром; Б — в виде хребта полипептидной цепи, составленного из объемно изображенных NH, СО- и CHR-групп; атомы водорода и кислорода, участвующие в образова­нии водородных связей, помечены знаками «+» и «—» соответственно. Модель в виде бумажной ленты может быть использована в курсе химии средней школы и на кружковых занятиях со школьниками по органической химии

Первая модель молекулы белка — миоглобина (рис. 33), отражающая его тре­тичную структуру, была создана Дж. Кендрю с сотр. (1957). На рис. 34 приведены схематические изображения третичной структуры молекул миоглобина, рибонуклеазы, лизоцима и химотрипсиногена. Несмотря на большие трудности, за истекшие три с половиной десятилетия удалось установить третичную структу­ру почти трехсот белков, причем более трех десятков из них — в СССР. В нашей стране, в частности, выяснена структура пепсина, леггемоглобина, аспартатаминотрансферазы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, пластоцианина, фитогемагглютинина, у-кристаллина, пирофосфатазы, ряда рибосомальных бел­ков, актиноксантина, лектина, лейцинаминопептидазы, а- и ß-интерферона, лейцинспецифичного белка, родопсина, тубулина, гидрогеназы, метанмонооксигеназы и др. Ниже некоторые из них будут охарактеризованы более подробно.

Полагают, что третичная структура белковой молекулы определяется ее первичной структурой, так как решающая роль в поддержании характерного для третичной структуры расположения полипептидной цепи в пространстве принадлежит взаимодействию радикалов аминокислот друг с другом. Воз­можные типы связей между радикалами представлены на рис. 35. Особое значение в поддержании третичной структуры белка придают дисульфидным мостикам: именно они в ряде белков (см. рис. 29, 34 и 35) прочно фиксируют расположение участков полипептидной цепи (или цепей) по отношению друг к другу. Таким образом, местоположение в молекуле белка остатков цистеина (и других аминокислот) предопределяет характер межрадикальных связей и, следовательно, третичную структуру. Конечно и здесь, при замыкании дисуль­фидных мостиков, в частности, реализуются далеко не все возможности их возникновения, резко отличающиеся от расчетных (по Т. Крейтону, при пяти SS-связях в белковой молекуле число их комбинаций достигает 945, при 10 — 654729075, а при 25 — превышает 5,8 ∙ 10³⁰).

Рис. 33. а- и ß-Структуры во фрагменте молекулы цитохрома b₅ и а-спиральные участки в моле­куле миоглобина:

А — фрагменты полипептидной цепи цитохрома (остатки 21—25, 28—34, 50—54 и 73—79), образующие ß-слой, показаны толстыми линиями, сам слой отмечен значками ß; четыре а-структуры (остатки 34—39,40—50, 54—63,64—73) изображены в аиде цилиндров; между попарно объединенными a-спиралями располагается простетичсекая группа цитохрома b₅, содержащая атом железа; Б — восемь а-спиральных участков в молекуле миоглобина (обозначены буквами латинского алфавита) резко преобладают над изгибами полипептидной цепи (обозначены сочетаниями AB, ВС и т. д.) по протяженности и пересекаются под различными углами; черный диск в верхней левой части молекулы — группа гема с атомом железа в центре

Рис. 34. Третичные структуры миоглобина (А), лизоцима (Б), рибонук­леази (В) и химотрипсиногена (Г)

Во всех случаях показаны конфигурация и расположение в пространстве хребта полипептидной цепи. Радикалы аминокислотных остатков нигде не обозначены, кроме трех радикалов в моле­куле химотрипсиногена. А — заштрихованный диск — гем; пунктир — место прикрепления его к хребту полипептидной цепи посредством радикала гистидина; хорошо заметны а-спирали, составляющие 75% полипептидной цепи миоглобина; цифрами указаны номера аминокислот­ных остатков в полипептидной цепи (см. также рис. 33, б); Б — символами—S—S-обозначены дисульфидные мостики, образуемые при окислении радикалов цистеина; заметно, что a-cпиральная конфигурация присуща не более чем 1/3 полипептидной цепи; в верхней части молекулы видно углубление (щель), предназначенное для размещения субстрата, расщепляемого лизоци­мом; В — а-спиральных конфигураций почтя не видно; остальные условные обозначения, как в А и Б; Г — ясно выраженных а-спиралей не наблюдается;—S—S-связи обозначены точками, здесь же цифрами указаны порядковые номера соответствующих остатков цистеина; в центре молекулы выделены штриховкой радикалы гистидина (пятиугольники) и радикал серина (корот­кий двурогий отрезок), образующие активный центр химотрипсина (после активирования химотрилсиногена), ответственный за гидролиз пептидных связей

Рис. 35. Типы связей между радикалами аминокислотных остатков в белковой молекуле:

а — электростатическое взаимодействие; б — водородные связи; в — взаимодействие неполярных боко­вых цепей, вызванное вталкиванием лиофобных радикалов в «сухую зону» молекулами растворителя (так называемая «жирная капля»); г — дисульфидные связи. Двойная изогнутая линия обозначает хребет полипептидной цепи

Кроме ковалентных связей третичная структура белковой молекулы поддерживается силами слабых взаимодействий (рис. 35). Рассмотрение пол­ных химических структур некоторых белков показало, что в их третичной структуре отчетливо выявляются зоны, где сконцентрированы гидрофобные радикалы аминокислот и полипептидная цепь фактически обматывается вокруг гидрофобного ядра. Более того, в ряде случаев в белковой молекуле обособляются два и даже три гидрофобных ядра, в связи с чем возникает двух- или трехъядерная структура. Такой тип строения молекулы характерен для многих белков, обладающих каталитической функцией (рибонуклеаза, лизоцим и др.).

Данные о полной химической структуре молекул ряда белков явились отправным пунктом для создания учения о доменном принципе строения белковой молекулы. Под доменом понимают обособленную область молекулы белка, обладающую в определенной степени структурной и функциональной автономией. У ряда ферментов, например, обособлены коферментсвязывающие домены. С учением о доменном принципе строения белков связано постепенно внедряющееся в белковую химию развитие представлений об элементах однотипности, блочности, стандартности третичной структуры бел­ков, об ограниченности набора пространственных упаковок полипептидных цепей, реально существующих в природных белках.

Сейчас домены считают фундаментальными элементами структуры белко­вых молекул, и соотношение и характер компоновки а-спиралей и ß-слоев, как полагают, дает для понимания эволюции белковых молекул и филогенетиче­ских связей больше, чем сопоставление первичных структур. Причина этого лежит в том, что в процессе эволюции происходило слияние доменов, их удвоение, возникновение псевдосимметричных доменов из повторяющихся субдоменов; некоторые из этих событий связаны с дупликацией генов и други­ми изменениями генетического аппарата.    

Есть много оснований полагать, что третичная структура белковой моле­кулы возникает совершенно автоматически. Движущей силой, свертывающей полипептидную цепь белка в строго определенное трехмерное образование, является взаимодействие аминокислотных радикалов с молекулами окружа­ющего растворителя. При этом лиофобные радикалы вталкиваются внутрь белковой молекулы, образуя там сухие зоны («жирная капля»), а лиофильные — ориентируются в сторону растворителя. В некоторый момент достига­ется энергетически выгодная конформация молекулы в целом, и белковая молекула стабилизируется.

Самоорганизация полипептидной цепи определенного белка в только ему присущую уникальную пространственную структуру, т. е. процесс возникнове­ния третичной структуры, проходит в несколько этапов (рис. 36).

На конформацию возникшей глобулы оказывают сильное влияние такие факторы, как pH среды, ионная сила раствора, а также взаимодействие белковых молекул с другими веществами, что лежит в основе регуляции обмена веществ, в частности аллостерической регуляции активности фер­ментов.

Разработка представлений о самоорганизации белковых глобул сопровож­далась не только введением понятия о доменах, о чем уже было сказано выше, но и новым подходом к характеристике уровней структуры белковых тел: к ним добавился упомянутый уже доменный уровень и надвторичная структу­ра. Под последней подразумевают закономерности возникновения в процессе свертывания полипептидной цепи элементарных структур, представленных ß-слоями (ß, ß'-структура), сочетанием а-спиральных участков (а, а'-структура) или тех и других одновременно (рис. 37). Преобладаю­щей среди надвторичных структур оказалась топология греческого ключа и греческого орнамента.

Существенно, что фрагменты полипептидной цепи, соответствующие доменам и даже субдоменам, способны независимо поддерживать близкую к нативной структу­ру. Так, цианбромидный фрагмент (121—316-й аминокис­лотные остатки) и его субдомен (205—316-й остатки) термолизина (протеолитического фермента из термо­фильной бактерии) самопроизвольно образуют стойко удерживаемую нативную структуру. Весь же процесс формирования третичной структуры таких, например, белков, как угольная ангидраза, а- и ß-лактоглобулин, фосфоглицераткиназа и лактамаза, занимает всего лишь 0,2 с. Вместе с тем выявлены факторы, лимитирующие скорость складывания полипептидов в процессе возник­новения третичной структуры; к их числу относится цис-транс-изомеризация связи X — про (где X — любая ами­нокислота), ускоряемая пептидилпролил-цис-транс-изомеразой. Рассмотренный механизм самоорганизации белковых глобул полу­чил изящное подтверждение в работах (начиная с 1988 года) по синтезу искусственных белков. Их создано к настоящему времени более двух десятков. Исходя из представлений о приуроченности а-спиралей, ß-слоев и участков неорганизованной полипептидной цепи к определенным аминокислотным по­следовательностям в синтетически полученных полипептидах, удалось сконст­руировать белковые молекулы, где автоматически и самопроизвольно воз­никали элементы вторичной и надвторичной структуры, неизбежно занима­ющие заранее рассчитанные позиции при формировании пространственной структуры молекулы такого искусственного белка. Так созданы методом белковой инженерии синтетические белки, получившие условные названия «Феликс» (от англ. four helices, т. е. из 4-х а-спиралей), «альбебетин» (построен из а-спиралей и ß-слоев в соотношении 1:2, т. е. аль: бебе) и т. п. Более того, они обладали заранее запрограммированными свойствами и биологической активностью.

Рис. 36. Структурные превращения полипептидной цепи при форми­ровании белковой глобулы

На І этапе происходят локальные взаимодействия на различных участках всей полипептидной цепи, в результате которых возникают флуктуирующие а-спирали и β-слои. Образование а-спиралей инициируется с той точки полипептида, где сосредоточены остатки дикарбоиовых аминокислот, и терминируется в зоне остатков диаминокислот, тогда как центральная часть возникающих а-спиралей занята аминокислотными остатками с гидрофобными радикалами. На этом этапе самоорганизации белковой молекулы возникает максимально возможное количе­ство а-спиральных конформаций полипептида, охватывающее больную часть полипептидной цепи. Поэтому иллюстрируемая гипотеза самоорганизации белковых молекул получила назва­ние гипотезы избыточных спиралей. На II этапе осуществляется направленное сближение зародышевых структур, «схлопывание» а-спиралей и возникновение одного или нескольких гидрофобных ядер за счет контактов гидрофобных радикалов аминокислот а-спиралей. В этот момент возникает глобулярная структура. III этап сводится к компактизации зародышевых структур и преобразованию промежуточной, высокоспиральной глобулы в нативную глобулу. На IV этапе возникает окончательная, характерная для данного белка третичная структура молекулы

Рис. 37. Надвторичные структуры белка

Вместе с тем в течение последнего десятилетия взгляды на саморегуляцию процесса свертывания полипептидных цепей белков при формировании их третичной структуры in vivo существенно изменились. Оказалось, что приве­денные выше преобразования (см. предыдущую стр. и рис. 36) осуществля­ются не сами по себе, а под влиянием особых, предназначенных именно для этой цели специфических белков, названных шаперонами (так в Англии назы­вали пожилую даму, удерживающую от непродуманных контактов молодую девушку, впервые выходящую в свет под ее руководством). Будучи в большин­стве своем трубчатыми олигомерами, составленными из 10—90 кДа субъеди­ниц, объединенных в наложенные друг на друга семичленные кольца, они вовлекают внутрь олигомера пока еще неорганизованную полипептидную цепь и контролируют ход образования ею вторичных и надвторичных струк­тур и их взаимную пространственную укладку (см. рис. 36), обеспечивающую возникновение третичной, присущей нативной (функционально значимой) гло­буле данного белка.

Однако и эта концепция, по-видимому, — не последнее слово в далеко неоднозначно решаемой проблеме складывания (фолдинга) полипептидных цепей. Исходя из экспериментальных и теоретических подходов, разработан­ных в процессе исследований кода белкового синтеза (см. ниже, гл. VII) высказано предположение (Л. Б. Меклер и Р. Г. Идлис; Г. И. Чипенс) о су­ществовании общего стереохимического генетического кода, позволяющего понять, как трехмерные молекулы белков сформировались из линейных поли­пептидных цепей. Суть вопроса сводится к наличию кода взаимодействия аминокислотных остатков друг с другом, что обеспечивает реализацию ин­формации, уже заложенной в первичной структуре белка (и, естественно, в мРНК и ДНК) в виде элементов вторичной и надвторичной структур и, в конечном счете, в виде уникальной третичной структуры данного белка.

Четвертичная структура белка. Ранее уже было отмечено, что крупные молекулы белков состоят, как правило, из субъединиц со сравнительно небо­льшой молекулярной массой. Такие молекулы называют эпимолекулами (сверхмолекулы) или мультимерами, а составляющие их элементы — субъеди­ницами или протомерами.

Структура, характеризующаяся наличием в белковой эпимолекуле опреде­ленного числа полипептидных цепей (субъединиц), занимающих строго фикси­рованное пространственное положение, вследствие чего белок обладает той или иной биологической активностью, называется четвертичной.

От четвертичной структуры следует отличать олигомерное и агрегированное состояние белка. Структура, характеризующаяся существованием в составе белковой частицы нескольких полипептидных цепей, число которых изменяет­ся в определенной пропорции, называется олигомерной. Крайне важно, что, несмотря на относительное постоянство числа полипептидных связей в олиго­мере белка и их упорядоченное расположение, у олигомера не возникает биологической активности. Так, например, сывороточный альбумин быка существует в виде мономера (М = 68000), димера (М = 136000), тримера (М = 204 000) и тетрамера, причем мономеры, объединяясь в олигомерные структуры, располагаются в составе ди-, три- и тетрамера упорядоченно. Однако это не сопровождается возникновением каких-либо новых качеств по сравнению с теми, которыми обладает мономер данного белка.

Под агрегированным состоянием белка подразумевают такую структуру белковых частиц, которая представлена неопределенным и изменяющимся в широких пределах числом полипептидных цепей. При этом агрегация моно­меров тоже не приводит к формированию каких-либо особых свойств у белка, находящегося в таком структурном состоянии. Так, цитохром с (и другие цитохромы) обладают резко выраженной способностью к агрегации молекул друг с другом, но этому явлению не сопутствует изменение свойств фермента.

Сейчас выяснена четвертичная структура нескольких сотен белков. В 1965 г. информация о четвертичной структуре ограничивалась примерно 20 белками; в 1970 г. появилась первая солидная сводка, включавшая 108 бел­ков, а в 1976 г. Д. Дарнелл и И. Клотц опубликовали таблицу, содержавшую перечень свыше 500 белков и данные о молекулярной массе мультимеров, протомеров и количестве последних в эпимолекуле.

Оказалось, что число субъединиц в эпимолекулах колеблется в очень широких пределах: от 2 до 162. Наиболее часто в составе молекул-мультимеров насчиты­вается 2 или 4 протомера, гораздо реже — 6, 8, 10, 12 или 24 и в редчайших случаях — их нечетное количество. Четвертичной структурой обладают в основном белки с молекулярной массой выше 50000—60000, а белки с меньшими молекулярными массами существуют, как правило, в виде мономеров. Критиче­ским пределом молекулярной массы белковой молекулы, сверх которого белок в большинстве случаев обладает четвертичной структурой, считают 100 000. Что касается молекулярных масс субъединиц, то они принимают самые разнообраз­ные значения, от нескольких тысяч (например, 6000 у инсулина) до 330000 (у каждой из двух субъединиц тиреоглобулина — белка щитовидной железы, ответственного за биосинтез гормона тироксина — см. гл. XII).

Классическим примером белка, имеющего четвертичную структуру, явля­ется гемоглобин (рис. 38). Молекула гемоглобина (М = 68000) построена из четырех субъединиц с М = 17000 каждая. Первичная, вторичная и третичная структуры субъединиц молекулы гемоглобина полностью выяснены. Они оказались попарно идентичными и были названы субъединицами типа оси ß. Субъединица типа а представлена полипептидной цепью из 141 аминокис­лотного остатка, ß — из 146. Третичная структура их сходна. Четыре субъеди­ницы (две типа ос и две типа ß) соединяются в единую молекулу гемогло­бина, располагаясь в углах почти правильного тетраэдра (рис. 38, Б). Та­ким образом, возникает почти шаровидная молекула с параметрами 0,50 х 0,55 х 0,64 нм.    

Рис. 38. Четвертичная структура белковых молекул:

А — модели субъединиц гемоглобина типа а (слева) и ß (справа). Блоки, из которых составлены модели, характеризуют распределение электронных плотностей в разных частях молекулы; черная (слева) и белая (справа) линии указывают расположение хребта полипептидной цепи; Б — трехмерная модель молекулы гемоглобина; субъединицы типа а (светлые) и ß (темные) расположены по углам почти правильного тетраэдра, темные диски — группы гема; В — модель молекулы вируса табачной мозаики: снаружи видны белковые субъединицы, темная спираль — нуклеиновая кислота; Г — расположение субъединиц в молекуле вируса табачной мозаики (разрез)

Принципиальный интерес для будущего учителя химии и биологии пред­ставляет вопрос о том, как взаимосвязаны структура гемоглобина с его функцией—способностью связывать, переносить и легко отдавать кислород. Это явление детально изучается в средней школе. Непосредственно молекула кислорода присоединяется к Fe²⁺, закрепленному в центре молекулы гема (рис. 39), который, в свою очередь, удерживается в гидрофобном кармане каждой из субъединиц, будучи присоединен координационными связями к имидазольным радикалам гистидина, расположенным в дистальной и про­ксимальной частях полипептидной цепи, образующей а- или ß-протомер гемо­глобина. Присоединение кислорода к Fe²⁺ идет без изменения валентности последнего на одну из его свободных координационных связей; при этом радиус атома Fe²⁺ уменьшается и он вместе с О₂ перемещается в плоскость порфиринового кольца. Здесь он удерживается до тех пор, пока молекула гемоглобина не будет перенесена в ткань с более низким содержанием О₂, где и происходит обратный процесс отдачи кислорода. И связывание О₂, и его высвобождение сопровождается конформационными изменениями структуры а- и ß-субъединиц гемоглобина и их взаимного расположения в мультимере.

Рис. 39. Структура активного центра и механизм связывания кислорода субъединицей гемоглоби­на (пояснения в тексте)

На рис. 38 приведена также схе­ма строения сложного белка (нуклепротеина)—вируса табачной мозаи­ки. Его гигантская молекула (М = 40 000 000) содержит небольшое количество (около 6%) РНК, осталь­ное приходится на белок. Белковая часть складывается из большого числа (2130) субъединиц с М = 17 500 каждая. Молекула вируса табачной мозаики представляет собой полую палочку длиной около 300 нм и тол­щиной примерно 17 нм, с отверсти­ем в центре диаметром в 4 нм. Каж­дая субъединица имеет размеры 2 x 7 нм. Субъединицы расположены по спирали, каждый виток которой образован примерно 16 субъедини­цами. Молекула нуклеиновой кисло­ты, следуя спиральному располо­жению субъединиц, проходит между их рядами. Вдоль молекулы рас­полагается свыше ста витков из бел­ковых субъединиц.

Самое поразительное явление, на­блюдающееся при изучении четвер­тичной структуры белковых молекул, состоит в том, что объединение протоме­ров в молекулу мультимера осуществляется самопроизвольно. Предполагают, что в молекуле каждого протомера есть специфические участки, взаимодей­ствующие с таковыми в других протомерах. При соединении протомеров в мультимер возникают ионные связи. В их формировании принимают участие ионы металлов и иногда низкомолекулярные органические соединения. Однако наибольший вклад в поддержание целостности структуры мультимеров вносят силы слабых взаимодействий, а именно—гидрофобные взаимодействия и водо­родные связи; суммарный эффект тех и других достаточно велик» чтобы обеспечить стабилизацию четвертичной структуры белков. Как вне организма, так, видимо, и в клетках мультимеры способны обратимо диссоциировать на протомеры.

Принципиально важно, что малейшее изменение третичной структуры протомеров делает невозможным соединение их в молекулы мультимера, что резко сказывается на биологической активности белка. Поскольку третичная структура белка задается его первичной структурой, а также зависит от ряда других факторов (pH среды, концентрация солей и т. п.), то даже незначитель­ное изменение первичной структуры белка или стандартных условий в клетке приводит к изменению функциональной активности белков. Указанные явле­ния лежат в основе регулярных процессов в организме.