Основы биохимии - Филиппович Ю. Б. 1999

Биологическое окисление
Окисление, сопряженное с фосфорилированием АДФ

Субстратное фосфорилирование. Примерами сопряжения окисления с фос­форилированием на уровне субстрата могут служить реакции окисления 3-фосфоглицеринового альдегида в 1,3-дифосфоглицериновую кислоту, 2-фосфоглицериновой кислоты — в 2-фосфоенолпировиноградную, а-кетоглутаровой кислоты — в янтарную кислоту (здесь фосфорилируется ГДФ — см. рис. 117). С возникающих при этом соединений фосфат, связанный макроэргической связью, легко передается на АДФ (или ГДФ). Один из примеров такого сопряжения и механизм переноса активированного фосфата на АДФ детально рассмотрены выше (см. рис. 114). Однако посредством реакций субстратного фосфорилирования образуется сравнительно небольшое количе­ство АТФ (рис. 128).

Рис. 128. Локализация синтеза АТФ при субстратном и окислительном фосфорилировании (пояснения в тексте)

Окислительное фосфорилирование. Главная масса АТФ у аэробных организ­мов синтезируется путем окислительного фосфорилирования в митохондри­ях — этих поистине энергетических фабриках клетки.

Атомы водорода, снятые с субстратов в цикле дикарбоновых и трикарбоновых кислот, при ß-окислении высших жирных кислот, при пируватдегидрогеназной, глутаматдегидрогеназной и некоторых других реакциях поступают в дыха­тельную цепь ферментов внутренней мембраны митохондрий. Универсальным донором атомов водорода для дыхательной цепи ферментов служит НАДН.

Рис. 129. Компоненты дыхательной цепи митохондрий:

E'₀ — окислительно-восстановительные потенциалы компонентов дыхательной цепи; ∆Е₀ — разность потенциалов между компонентами дыхательной цепи в точках сопряжения с фосфорилированием АДФ (подчеркнуты толстой черной линией); I, II, III — точки сопряжения. Дыхательная цепь митохондрий более сложна, чем это показано на рисунке. При определенных условиях из нее можно выделить 4 комплекса, каждый из которых характеризуется своей молекулярной массой, полипептидным составом и значениями окислительно-восстановительных потенциалов (Е'₀). Комплекс I: М = 700—900 кДа, 2S полипептидов; комплекс II: М = 140 кДа, 4—5 полипептидов; комплекс III: М = 250 кДа, 9—10 полипептидов; комплекс IV: М = 160—170 кДа, S полипептидов. Дыхательная цепь примыкает к АТФ-синтазному комплексу (комплекс V: М = 500 кДа, 12—14 полипептидов), показанному на рис. 130 и 131. Таким образом, с трансформацией энергии в митохондриях связано около 70 различных полипептидов в 6 типов фосфолипидов сопрягающей мембраны (см. рис. «Блочная структура митохондриальной цепи» на форзаце в начале учебника)

Следовательно, и в этом случае атомы Н перед поступлением в дыхательную цепь передаются на НАД⁺ (рис. 128).

Другим первичным источником атомов водорода и электронов в дыхатель­ной цепи сложит восстановленный флавопротеин, если он выполняет роль первичной дегидрогеназы, как, например, в случае окисления янтарной кисло­ты в цикле трикарбоновых и дикарбоновых кислот (см. рис. 117). Флавопроте­ин, но несколько иной природы, служит передаточной инстанцией для атомов водорода и электронов от НАДН к убихинонпротеину дыхательной цепи.

На рис. 129 представлена дыхательная цепь ферментов митохондриальной мембраны. Естественно, что она открывается НАДН, с которого атомы Н передаются на первый белковый компонент дыхательной цепи — флаво­протеин, несущий флавинмононуклеотид (ФМН) в качестве кофермента. Остальные компоненты дыхательной цепи располагаются в порядке возраста­ния их нормальных (измерены при 1 М концентрации и температуре 25° С, что обозначают индексом Е₀ и pH 7,0 и маркируют значком ') окислительно­восстановительных потенциалов (E'₀), обеспечивающих упорядоченную пе­редачу атомов водорода и электронов по такой редоксцепи.

Самой примечательной особенностью дыхательной цепи ферментов явля­ется наличие в ней участков, где соседние компоненты резко отличаются значениями окислительно-восстановительных потенциалов (∆E₀):

Нормальные окислительно-восстановительные потенциалы соединений, участвующих в биологическом окислении

Именно здесь происходит сопряжение окисления с фосфорилированием АДФ (рис. 129), так как разность энергетических уровней электрона, транспортиру­емого с огромной скоростью (около 1 мс от одного переносчика к другому), вполне достаточна для синтеза макроэргической связи и составляет 51 кДж для I, 36 — для II и 80,7 кДж для III точки сопряжения. В целом интенсивность окислительного фосфорилирования определяется энергетическим зарядом, т. е, соотношением моно-, ди- и трифосфатов аденозина:

Рис. 130. Структура митохондрии (A) и схема расположения ферментов дыха­тельной цепи и АТФ-синтазного комплекса в ее внутренней мембране (Б):

ФМН — флавопротеин с флавинмононуклеотидом я качестве коферменте; FeS — железосерные белая; Q — убихинонпротеин; b, c₁ и с — цитохромы; а — цитохромоксидаза

Рис. 131. Трансмембранный перенос электронов и протонов и сопряжение его с синтезом АТФ (обозначения те же, что на рис. 129)

Мембраны, несущие ферменты переноса электронов и сопряженного с ним фосфорилирования, называются сопрягающими. К ним относятся: внутренняя мембрана митохондрий, мембрана тилакоидов хлоропластов зеленых расте­ний, мембрана хроматофоров фотосинтезирующих бактерий и клеточные мембраны аэробных бактерий, обладающих дыхательным типом энергетики. Они характеризуются толщиной в 7,0—9,0 нм, преобладанием белков над липидами (2:1), низким содержанием холестерола и наличием кардиолипина; примерно третья часть входящих в их состав белков принадлежит ферментам дыхательной цепи, собранным в ансамбли (рис. 129), — в каждой митохондрии клеток печени крысы, например, их содержится несколько тысяч.

Наиболее полно изучены структура и функция сопрягающей мембраны митохондрий. Наряду с дыхательным ансамблем ферментов в ней находится АТФ-синтазный комплекс, ответственный за образование АТФ. Каким же образом расположены они в митохондрии? Ответ на этот вопрос дает рис. 130. И тот и другой ферментные комплексы локализованы во внутренней мембране митохондрий (рис. 130, Б), причем АТФ-синтазный комплекс представлен так называемыми грибовидными выростами, которые усеивают внутреннюю ме­мбрану и обращены в сторону матрикса митохондриальных частиц.

Проблема сопряжения окисления с фосфорилированием необыкновенно сложна и далека еще от окончательного разрешения. Ранние гипотезы по этому вопросу: гипотеза химических переносчиков (Е. Слейтер, 1953) и конформационная гипотеза (П. Бойер, 1964) представляют в настоящее время лишь исторический интерес, хотя отдельные элементы той и другой в некото­рой мере присутствуют в общепризнанной сейчас хемиосмотической гипотезе П. Митчела, поддержанной и развитой в нашей стране благодаря трудам В. П. Скулачева и сотр.

Согласно хемиосмотической гипотезе, именно структурные и функцио­нальные особенности сопрягающей мембраны (этот термин введен в био­энергетику В. П. Скулачевым) обеспечивает биосинтез АТФ. В процессе функционирования дыхательной цепи ферментов в сопрягающей мембране митохондрий, не проницаемой ни для НАДН, ни для протонов, происходит активный перенос шести Н⁺ из матрикса в межмембранное пространство (рис. 131) на каждую пару электронов, проходящих по электронотранспортной цепи. По поводу механизма этого переноса высказаны разные мнения. Сущ­ность некоторых из них ясна из рассмотрения рис. 131. Предполагают также, что перенос протонов идет при участии протонных транслоказ — специфи­ческих белков, локализованных в сопрягающей мембране и обеспечивающих перенос протонов сопряженно с транспортом электронов при помощи бел­кового комплекса, как, например, в случае цитохромоксидазы (рис. 132) или НАДН: ß-оксидоредуктазы.

Рис. 132. Протонная помпа, сопряженная с цитохром с-оксидазой митохо­ндриальной мембраны

При М = 140000 цитохром с-оксидаза состоит из 7 субъединиц, содержащих 2 атома Cu и 2 атома Fe (в составе гема, показан овальным кружком), соединенных координационными связями с атома­ми азота радикалов гис. Так как атомы Сu я Fe цитохрома а ∙ а₃ находятся на расстоянии 3,5 нм, то возможен только тоннельный перенос электронов между ними. Цитохромоксидаза, изменяя кон­формацию при переносе электронов, либо сама выполняет функцию протонной помпы, либо для этого служит тесно прилегающий к ней белок. Как видно из рисунка, механизм активирования молекулярного кислорода цитохромоксидазой вполне аналогичен таковому у диоксигеназ и некоторых монооксигеназ, т. е. осуществляется за счет передачи на кислород электронов с Fe²⁺ и Cu⁺.

В результате создается трансмембранная разность потенциалов, так как с внешней стороны внутренней мембраны митохондрий, в межмембранном пространстве, накапливаются Н⁺, а на внутренней ее стороне, в матриксе, — ОН^- (см. рис. 131). Возникает градиент электрохимического потенциала Н⁺ (его обозначают как ∆μ_Н+). Он складывается из градиента электрического потенциала — ∆ψ и градиента концентрации водородных ионов — ∆р_Н и явля­ется движущей силой синтеза АТФ.

Естественно, что ионы Н, накопившиеся в межмембранном пространстве митохондрии, перенесенные туда за счет потерянной электронами энергии в процессе их транспорта по дыхательной цепи ферментов и перехода с более высокого энергетического уровня в окисляемом субстрате на более низкий энергетический уровень в активированной молекуле кислорода (см. рис. 129), стремятся вернуться в митохондриальный матрикс. Энергезированная, электриче­ски заряженная внутренняя мембрана митохондрий способна деэнергезироваться, разрядиться. Этот процесс осуществляется при помощи протонной АТФазы.

Протонная АТФаза (Н⁺-АТФаза) — липопротеиновый комплекс, гидроли­зующий АТФ сопряженно с трансмембранным переносом водородных ионов против их электрохимического градиента (∆μ_Н+). Энергия для такого переноса Н⁺ против градиента их концентрации черпается за счет энергии распада­ющейся макроэргической связи в молекуле АТФ при ее гидролизе. В условиях нарушения целостности комплекса F0F₁ (рис. 132) митохондрий, Н⁺-АТФаза ускоряет именно этот процесс, обеспечивая обратный транспорт Н⁺ и со­здание ∆μ_Н+- Но в составе энергезированной митохондриальной мембраны, при нормальном состоянии комплекса F0 ∙ F₁ функция протонной АТФазы сводится не к переносу ионов водорода из матрикса в межмембранное про­странство, а, наоборот, к транспорту протонов внутрь митохондрии, к снятию электрохимического градиента Н⁺ и, само собой разумеется, к синтезу (сопря­женно с переносом Н⁺ с внешней стороны сопрягающей мембраны на ее внутреннюю сторону) АТФ. Поэтому ее называют также АТФ-синтазоЙ, что подчеркивает ее истинную функцию в митохондриальной мембране.

Рис. 133. Строение протонной АТФазы (пояснение в тексте)

АТФ-синтаза (протонная (АТФаза) представлена двумя белковыми ком­плексами, состоящими, в свою очередь, из субъединиц (рис. 133, А). Первый из них, полностью «утопленный» в сопрягающую мембрану и пронизывающий ее насквозь, состоит из трех видов гидрофобных полипептидных цепей (с раз­личающимися в зависимости от объекта молекулярными массами порядка 19000—24000, 13500—18000 и 5400—8400 в соотношениях 1:2:5 или близких к этому) и обозначается как F₀. Его функция состоит в доставке протонов из межмембранного пространства, куда он открывается, ко второму белковому комплексу, плотно к нему примыкающему.

Второй комплекс включает в свой состав пять различных белков и выступа­ет, будучи частично погруженным, из сопрягающей мембраны в виде грибовидного выступа. Это F₁-фактор или сопрягающий фактор, непосредственно ответственный за биосинтез АТФ. Его молекулярная масса, слегка варьирую­щая в зависимости от объекта выделения, составляет в среднем 368000, а субъединицы представлены полипептидами с М ~ 57 000 (а), 53 000 (ß), 34 000 (у), 17000 (δ) и 10000 (ε). По данным ряда авторов, субъединичный состав сопрягающего фактора подчиняется формуле a₃β₃уδε. Полагают, что катали­тический центр, ускоряющий реакцию синтеза АТФ из АДФ и Н₃РO₄, нахо­дится на ß-субъединице, а а-субъединица прикрывает его от воздействия ингредиентов митохондриального матрикса. Есть также мнение, что Е-субъединица регулирует деятельность протонной АТФазы, ингибируя ее способ­ность гидролизовать АТФ. Аналогично построены и действуют хлоропластная и бактериальная Н⁺-АТФазы.

Каким же образом возникает АТФ при посредстве АТФ-синтазы? На этот вопрос еще нет исчерпывающего ответа, но предложено несколько заслужива­ющих внимания концепций.

Первая из них сводится к предположению, что протоны, поступающие по протонпроводящему каналу F₀, активируют неорганический фосфат (Р_H), связан­ный активным центром ß-субъединицы, отнимая от него ОН-группу (реакция элиминирования воды). Одновременно ОН-группа концевого фосфата АДФ, также присоединенного к активному центру ß-субъедийицы, теряет протон за счет взаимодействия с ОН^- -группой матрикса (где ОН^- -группы накапливают­ся в результате переноса Н⁺ в межмембранное пространство, см. рис. 131). Активированные фосфат и АДФ соединяются и образуют АТФ (рис. 133, Б, 1).

Вторая концепция состоит в допущении, что ионы Н в активном центре сопрягающего фактора активируют фосфат и карбоксильную группу одной из Субъединиц F₁-фактора, в результате чего возникает фосфоэнзим, где фосфат присоединен макроэргической связью. При последующем взаимодействии АДФ и фосфоэнзима образуется АТФ (рис. 133, Б, 2). Здесь в видоизмененном состоянии представлена гипотеза переносчиков.

Tретья концепция исходит из предположения, что роль транслоцируемых в F₁-фактор протонов состоит в изменении конформации F₁-фактора. Обладая не менее чем двумя центрами связывания АДФ и неорганического фосфата, F₁-фактор способен синтезировать АТФ из АДФ и Р_H, если связывающий центр находится в закрытом состоянии. При этом АДФ и Р_н в нем находятся в окружении аминокислотных радикалов, способствующих отнятию молекулы воды и синтезу АТФ (рис. 133, Б, 3, правая сторона F₁-фактора). При трансло­кации протонов центр связывания открывается, и АТФ из него поступает в матрикс (левая сторона F₁-фактора на рис. 133, Б.3), а ее место занимают АДФ и Р_H Новый цикл конформационных перестроек переводит этот центр связывания в закрытое состояние с одновременным высвобождением готовой АТФ из другого связывающего центра, переходящего в открытое состояние. Легко заметить, что в этом объяснении механизма биосинтеза АТФ использо­ваны идеи конформационной гипотезы сопряжения окисления с форфорилированием.

В последнее время появились новые точки зрения на механизм АТФ-синтазной реакции. А. Д. Виноградов предложил кинетическую модель, в соответствии с которой синтез АТФ в АТФазном комплексе и гидролиз АТФ F₁-АТФазой идут разными путями и каталитически ускоряются раз­ными формами фермента, причем синтазные центры локализованы на а-субъединице, агидролазные — на ß-субъединице. Л. Ф. Дмитриев обосно­вал вариант химической гипотезы, где роль интермедианта играет энергизированный липидный радикал сопрягающей мембраны и учитывается роль электрохимического потенциала и внутримембранных протонов в процессе сопряжения окисления с фосфорили­рованием.

Рис. 134. Гигантские разветвленные митохон­дрии в клетках почечных канальцев

Кроме биосинтеза АТФ, электрохи­мический потенциал ∆μ_H+, возникаю­щий на сопрягающей мембране и пере­водящий ее в энергетически заряжен­ное, энергезированное состояние, яв­ляется источником энергии для меха­нической работы (например, для дви­жения жгутиков у мутантов бактерий, утративших синтез АТФ за счет сопря­жения окисления с фосфорилировани­ем, вращения хлоропластов у харовых водорослей, вбуравливания цианобак­терий в ил и т. п.), для поддержания осмотического давления и переноса ве­ществ против градиента концентрации, для теплопродукции при утрате мито­хондриями дыхательного контроля (например, при переохлаждении жи­вотных, в период испарения цветами эфирных масел для привлечения насе­комых и др.), для обращения вспять переноса электронов в дыхательной цепи ферментов, для синтеза пирофосфата и полифосфатов (как макроэргических соединений).

Источником энергезированного состояния мембраны может быть также возникновение электрохимического потенциала ∆μ_Na+, что характерно для некоторых морских бактерий. У них ∆μ_Na+ используется для приведения в движение жгутиков, создания солевых градиентов и, что самое важное, для синтеза АТФ при посредстве Na⁺-зависимой АТФазы (Na⁺-АТФ-синтазы). В связи с этим возникает вопрос о статусе других металлозависимых АТФаз (Na⁺, К⁺-АТФазы, Са²⁺-АТФазы) и не исключено, что эта область исследова­ний станет в перспективе «горячей точкой» биоэнергетики.

Сказанное, по мнению В. П. Скулачева, наводит на мысль о том, что возникновение ∆μ_H+, а в ряде случаев ∆μ_Na+ на сопрягающей мембране есть универсальный способ запасения энергии в клетке, предшествовавший ее кон­сервированию в макроэргических связях АТФ.

Более того, современные наблюдения говорят о том, что в клетках, например мышечных, существует митохондриальный ретикулум, при помощи которого митохондрии связаны в единую цепь или представляют собой одну гигантскую разветвленную митохондрию. По ее энергезированной мембране ∆μ_H+ может передаваться на значительные расстояния для того, чтобы в нужном месте обеспечить синтез необходимого количества АТФ или выполнить иные функции, присущие мембранному электрохимическому потенциалу (рис. 134).