Основы биохимии - Филиппович Ю. Б. 1999

Белки
Выделение белков

Хотя около двух десятков белков (инсулин, рибонуклеаза, лизоцим, цитохром с, соматотропный гормон, ß-липотрогаш, ацилпереносящий белок, а-бунгаротоксин, кобротоксин, кардиотоксин, ингибитор гастрина, ингибитор трипсина, аполипопротеин, ферредоксин др.) удалось синтезировать и, таким образом, сделать первый шаг на очень трудном пути их искусственного создания, синтезы эти очень сложны, трудоемки, длительны и дороги. Поэтому единственно реальным методом получения белков служит выделение их из природных источников. Но и это нелегкая задача, так как белки обладают особой чувствитель­ностью к действию большинства химических реагентов (кислот, щелочей, органических растворителей и др.) и разрушаются от обычных процедур, применяемых при очистке веществ (нагревание, перегонка, возгонка, экстракция и т. п.). Возможен также автолиз (самопереваривание) выделяемых белков. Белок очень легко теряет свои природные, присущие ему в естественном состоянии нативные свойства (растворимость, биологическую активность и т. п.), и переходит в денату­рированное состояние. Чтобы избежать денатурации белка в процессе его выделе­ния, все операции проводят в мягких условиях: при низкой (не выше + 5° С) температуре, избегая действия резких химических реагентов.

Впервые белок (клейковина) был выделен Я. Беккари из пшеничной муки в 1728 г. Эту дату принято считать годом зарождения химии белка. В 1762 г. началась работа по изучению белка молока — казеина (А. Халлер), затем с 1789 г. — белков крови (А. Фуркруа). За два с половиной столетия из природ­ных источников получены сотни различных белков и изучены их свойства.

Для успешного выделения белка из биологического объекта необходимо тончайшее измельчение тканей вплоть до разрушения клеточных стенок. Для этого используют (рис. 6) специальные валковые (А) или шаровые (Б) мель­ницы, в которых исходный материал многократно продавливается между тесно сближенными валками или расплющивается непрерывно сталкивающимися шарами. С этой же целью широко применяют гомогенизаторы (В и Г), в кото­рых материал либо измельчается острыми ножами, вращающимися с огромной скоростью (12000 об/мин и более), либо растирается между пришлифованными стенками стеклянных пробирки и пестика, либо в замороженном состоянии продавливается через фильеры специального пресса (Д).

Хорошие результаты дает метод разрушения клеточных оболочек путем попеременного замораживания и оттаивания ткани. Роль «рабочего инструмен­та» выполняют здесь кристаллики льда, разрывающие стенки клеток и освобож­дающие клеточное содержимое. Применяют также метод «азотной бомбы», заключающийся в насыщении суспендированных клеток газообразным азотом под высоким давлением, которое затем резко сбрасывают, — азот, проникший внутрь клеток, выделяется в виде газа и «взрывает» их.

Классификация методов разрушения (дезинтеграции) биологического материа­ла, отражающая разнообразие подходов, используемых с этой целью при выделении белков и других соединений из природных объектов, приведена в табл. 2.

Рис. 6. Устройство приборов для измельчения биологического материала при выделении белков;

А—валковая мельница (а₁ и а₂ — валки, вращающиеся навстречу друг другу; прямая стрелка указывает направление поступления измельчаемого материала); Б — шаровая мельница (б₁— корпус; б₂ — шары; стрелка указывает направление вращения корпуса); В — ручной гомогенизатор (в₁ — пестик; в₂ — корпус); Г — механический гомогенизатор (г₁ — нож; г₂ — камера для измельчения материала; г₃ — корпус с электродвига­телем и пусковым устройством; г₄ — крышка); Д — рабочая камера прибора для из­мельчения пресс-методом (д₁ — пространство, заполненное биологическим материа­лом; д₂ — плунжеры для продавливания материала; д₃ — стенки камеры; д₄ — перегородка с тончайшими отверстиями)

Когда достигнуто тонкое измельчение материала, переходят к следующему этапу—извлечению белков. Белки извлекают чаще всего солевыми растворами, взятыми в концентрации 8—10%. Подавляющая часть белков хорошо раство­рима в таких солевых растворах. Различные соли обладают разным раство­ряющим действием по отношению к белку. Ниже приведен ряд катионов и анионов, расположенных в порядке убывания их растворяющего действия:

Таблица 2 Классификация дезинтегрирующих воздействий по их природе (по Б. А. Фихте и Г. А. Гуревичу, 1988)

Таким образом, максимальным растворяющим действием должен обла­дать пирофосфат лития, минимальным — хлорид натрия.

Так как на растворение белков сильное влияние оказывает pH среды, боль­шинство солей применяют в виде буферных смесей (фосфатных, ацетатных, боратных, цитратных и т. п.). В последнее время широко используют буфер­ные смеси, составленные с применением органических соединений — трис-(оксиметил)-аминометана (HOCH₂)₃CNH₂ и его соли с НСl (трис-буфер); диэтилбарбитуровой кислоты и ее натриевой соли (веронал-мединаловый бу­фер); N,N-бис-(2-оксиэтил)-глицина (HOCH₂CH₂)₂NCH₂COOH (бициновый буфер); N- [трис-(оксиметил)-метил]-глицина (HOCH₂)₃CNHCH₂COOH (трициновый буфер) и т. п.

Хорошие результаты дает извлечение белков спирто-солевыми смесями. Металлопротеины, образующиеся при этом, обладают разной растворимо­стью в спирте, что позволяет извлекать индивидуальные белки при различной концентрации спирта. Весьма широко применяют для экстракции белков глицерин, предохраняющий их от денатурации.

Извлечению белков из биологического материала способствует его обработка детергентами: додецилсульфатом натрия, дезоксихолатом нат­рия, тритоном X-100, алкилгликозидами и триалкиламмониопропансульфонатами:

Перечисленные детергенты ослабляют гидрофобные белково-липидные и белок-белковые взаимодействия, результатом чего являются деструкция биологических мембран и высвобождение из них структурных и функциональ­ных белковых компонентов. 

Сказанное выше о выделении белков в основном относится к животным тканям Выделение белков из растительного материала неизмеримо труднее: здесь сложнее разрушить стенку клеток, более вероятна денатурация белков за счет их взаимодействия с дубильными веществами и т. п. Поэтому при выделе­нии белков из вегетативных органов растений используют специфические приемы: обработку тканей водно-эфирной смесью, резко повышающей прони­цаемость оболочки растительной клетки (метод Чибнелла), экстракцию бел­ков смесью фенола, уксусной кислоты и воды (метод Синджа) и др.

Рис. 7. Разностные диаграммы высали­вания белков:

А — белки сыворотки крови человеки: Б — белки ге­молимфы шелкопряда. Каждый столбик ни диа­грамме соответствует тому количеству белка, кото­рое выпало в осадок при изменении концентрации Na₂SО₄ на 0,005 (в единицах плотности раствора). Стрелки указывают на концентрации Na₂SО₄, явля­ющиеся пограничными для отделения фракций друг от друга

После экстракции смеси белков из биологического материала проводят разделение полученной смеси на индивидуальные белки, поскольку в состав растительных и животных тканей входит множество различных белков, экс­трагирующихся в той или иной пропорции в процессе выделения. Фракциони­рование белков ведут разными способами: солями, органическими раство­рителями, электрофоретически, хроматографически, методом молекулярных сит и т. п.

Метод фракционирования белков солевыми растворами основан на том, что каждый индивидуальный белок разделяемой смеси осаждается из нее при определенной концентрации той или иной соли, в то время как другие белки при данной концентрации соли остаются в растворе. Процесс осаждения белка из раствора под действием соли называется высаливанием. При дальнейшем насыщении солью выпадает следующий индивидуальный белок и, таким образом, последовательно наращивая содержание соли в реакцион­ной среде, можно один за другим выделить относительно чистые индивиду­альные белки. Чтобы определить те границы концентрации соли, в которых происходит осаждение определенного белка, строят разностные диаграммы (рис. 7).

Из органических растворителей для фракционирования белков широко при­меняют метиловый и этиловый спирты (во избежание денатурации белка процесс ведут при температуре около 5° С). В этих случаях также предвари­тельно строят разностные диаграммы. На рис. 8 приведены данные о концен­трациях этилового спирта при осаждении разных фракций белков сыворотки крови человека. Этот метод нашел широкое применение при выработке заме­нителей крови, так как позволяет извлекать из нее необходимые ингредиенты и длительно сохранять их. При фракционировании белков иногда сочетают высаливание и осаждение спиртом, применяя спиртосолевые растворы.

Метод осаждения ионами тяжелых металлов находит ограниченное приме­нение при фракционировании белков и осуществляется в большинстве случаев в сочетании с другими методами фракционирования (высаливание, осаждение органическими растворителями). Метод основан на взаимодействии ионов Hg, Zn, Ca, Ba, Pb, Fe, Cu, U и других тяжелых металлов с реакционноспособными аминокислотными радикалами белковой молекулы (Hg²⁺ — с сульфгидрильными группами, Zn²⁺ — с имидазольными, Са²⁺ и Ва²⁺ — с радикалами фосфосерина и т. п.).

Рис. 8. Диаграмма фракционирования белков плазмы крови человека этиловым спиртом

Метод электрофореза основан на способности различных белков переме­щаться под Действием электрического поля с неодинаковой скоростью (а иногда и в противоположных направлениях) в растворе, на влажной фильтровальной бумаге или в другой твердой опорной среде. Напряжение при этом устанавлива­ют от нескольких сотен до нескольких тысяч вольт, силу тока — в несколько десятков миллиампер. Скорость передвижения белковых молекул определенно­го вида к аноду или катоду является функцией электрического заряда, молеку­лярной массы и формы молекул, ионной силы, pH и состава буферного раствора, а также приложенных потенциалов. Сочетание перечисленных факто­ров всегда специфично для каждого индивидуального белка, и естественно, что разные белки обладают различной электрофоретической подвижностью.

Наибольшее распространение получил электрофорез в твердых поддер­живающих средах: целлюлозе, ацетилцеллюлозе, геле агар-агара, крахмаль­ном и полиакриламидном гелях. На электрофореграммах белки выявляют с помощью красителей: амидового черного (амидошварц 10В), бромфеноло­вого синего, кумасси бриллиантового голубого и др.:

Однако в 100—200 раз чувствительнее реакция обнаружения белков посред­ством окрашивания их в гелях аммиачными комплексами серебра.

Особенно перспективен метод электрофореза в твердых средах, приготов­ленных из сополимера акриламида и метиленбисакриламида, имеющего трех­мерную структуру:

В зависимости от соотношения в реакционной среде акриламида и N, N-метиленбисакриламидз трехмерная структура в процессе сополимеризации получается мелко-, средне- или крупноячеистой. При электрофорезе белковые молекулы с разной степенью легкости проходят через указанные ячейки, что и обеспечивает фракционирование белков. Так, при фракционировании белков сыворотки крови человека посредством электрофореза на бумаге наблюдают 6 фракций, в крахмальном геле — 10, а в полиакриламидном геле — 16 фрак­ций (рис. 9).

Еще большая дробность фракционирования белковых смесей вплоть до выделения индивидуальных белков обеспечивается при проведении электрофо­реза в поддерживающих средах с градиентом pH. Поскольку в этом случае положение белка на том или ином уровне в колонке или тонком слое носителя определяется значением его изоэлектрической точки, метод получил название изоэлектрического фокусирования (синонимы — электрофокусирование, изотахофорез). Градиент pH создается при посредстве специально синтезированных для этой цели О. Вестербергом полиаминополикарбоновых кислот — амфолинов, состав которых выражается следующей формулой:

где х = 2—3, a R—Н или —(СН₂)_х—СООН. Молекулярная масса амфолинов колеблется от 300 до 1000, причем в зависимости от соотношения в их молекулах третичных атомов азота и карбоксильных групп в водных раство­рах амфолинов обеспечивается диапазон pH от 3 до 10.

Рис. 9. Разрешающая способность твердых поддер­живающих сред при фракционировании белков сы­воротки крови человека методом электрофореза:

(А — целлюлоза; Б. В — крахмальный и полиакриламидный гели). На алектрофореграммах А, Б, В — левая мощная белковая фракция — альбумин; правая — комплекс у-глобулиноа, между ними — фракции остальных глобулинов. Во всех случаях исследован один и тот же препарат, нанесенный на зону старта в количестве 100, 80 и 5 мкл соответственно

Рис. 10. Механизм ионообменной хро­матографии белков

Механизм ионообменной хроматографии сводится к вытеснению противоионов, связанных с анионны­ми и катионными центрами ионообменника (І) ио­ногенными группировками белковых молекул (II) и связыванием последних с ионообменвиком за счет электростатического взаимодействия. В зависимо­сти от вида белка и особенно от соотношения в его составе радикалов главным образом дикарбоновых аминокислот и диаминокнслот суммарный эффект этих связей варьирует, вследствие него разные белки С неодинаковой скоростью вытесняются С ионообменника ионами проявителя (III и IV) и выходят из колонки раздельно. Затем ионообменник регенируют (10 полненную адсорбентом. В качестве адсорбента применяют производные целлюлозы и сефадекса (см. с. 325), несущие ионообменные группировки (аминоэтильные, сульфоэтильные, карбоксиметильные и др.), гель фосфата кальция, силикагель и другие носители. В тех случаях, когда носители из­бирательно связывают строго определенные белки, фракционирование бел­ковых смесей идет очень эффективно. Такой вид хроматографии называют хроматографией сродства или аффинной хроматографией. За последние 5 лет широкое распространение получила металлохелат аффинная хроматография белков, основанная на их способности обратимо сорбироваться на иммо­билизованных ионах переходных металлов, используя свободные коорди­национные связи последних.

Одной из ее модификаций является хроматография, основанная на гид­рофобном взаимодействии носителя (фенил- или октилсефароза) с соответст­вующими неполярными аминокислотными радикалами белковых молекул. - Применение эффективных сорбентов (различные производные силикагеля) и высокого давления при элюировании с них белков привело к возникновению ряда вариантов жидкостной хроматографии высокого разрешения.

Механизм ионообменной хроматографии белков представлен на рис. 10.

Для элюции адсорбированных белков с колонки используют солевые рас­творы, имеющие различные концентрации и значения pH. Если изменение концентрации солевого раствора осуществляется в процессе снятия белков с одной и той же колонки, такую элюцию называют градиентной. Элюат собирают небольшими порциями (по несколько миллилитров) в отдельные пробирки при помощи специальной установки — коллектора (сборщика) фрак­ций. Таких проб в процессе фракционирования белков на колонке хроматогра­фическим методом получают обычно несколько сотен. В результате проведе­ния цветной реакции на белок или путем измерения поглощения каждого раствора в ультрафиолетовой области спектра устанавливают содержание белка в каждой пробе. По этим данным строят кривую, из рассмотрения которой становится ясным, сколько фракций белка содержится в элюате и в какой серии пробирок находится каждая фракция. Одноименные пробы объединяют и из полученного раствора выделяют чистый белок.

Фракционирование белков методом молекулярных сит основано на раз­личной скорости перемещения белковых молекул (в зависимости от молеку­лярной массы) через колонку, заполненную специальным материалом — сефадексом¹. Сефадекс получают путем обработки эпихлоргидрином полисахаридадекстрана, в результате чего между молекулами последнего возникает то или иное число поперечных связей:

¹ Его название образовано из начальных слогов трех слов; separation (разделение), pharmacia (название шведской фирмы, выпускающей реактивы) и dextran (декстран). Применяют также используя простейшую аппаратуру. Распределение белков между фазами опре­деляется различиями в физико-химических свойствах фракционируемых белков и полимеров, входящих в состав верхней и нижней фаз: на основе комплекса свойств тех и других происходят взаимодействия (образование ионных и водо­родных связей, гидрофобные взаимодействия и др.), приводящие к накоплению определенного белка или группы белков в одной из полимерных фаз.

Аналогично этому обработка другого полисахарида — агарозы 2,3-дибром-пропанолом в резко щелочных условиях приводит к возникновению сетчатого полимера сефарозы, дающего гели, пригодные для фракционирова­ния белков с молекулярными массами в сотни тысяч дальтон.

В зависимости от числа поперечных связей в сефадексе и размера белковых молекул осуществляется та или иная степень проникновения последних внутрь гранул сефадекса, заполняющих колонку. Большие белковые молекулы, не способные пройти через сито из ячеек в гранулу, быстро выносятся из колонки с током элюента; мелкие молекулы белка, проникшие внутрь зерна сефадекса, удерживаются некоторое время последним и выходят из колонки с последу­ющими порциями элюата. Таким образом, колонка с сефадексом как бы просеивает через себя молекулы белка по их размерам, выпуская, как это ни парадоксально, первыми самые крупные молекулы (рис. 11). Так как гранулы сефадекса сильно разбухают в растворителе и образуют гель, этот метод называют также методом гельфильтрации.

Интересен предложенный П. А. Альбертсоном метод фракционирования белков с помощью двухфазных систем, составленных из водных растворов полимеров. При этом способе фракционирование осуществляется в мягких условиях (физиологические значения ионной силы и pH среды), а водные растворы полимеров оказывают стабилизирующее действие на разделяемые белки. Метод позволяет работать с любыми количествами вещества, аналогичные сефадексу материалы — молселект (сефадекс фирмы «Реанал», Венгрия), акрилекс и биогель Р (на базе полиакриламида), сефакрил (получают из аллилдекстрана и N, N'-метиленбисакриламила), сефарозу (получают из агарозы) и др. Перечисленные материалы нашли широкое применение не только для фракционирования белков, но и для разделения нуклеиновых кислот, высших углеводов и других биополимеров (см. также с. 325).

Рис. 11. Механизм разделения веществ по молеку­лярной массе на колонке с сефадексом:

А — колонка в начале работы: светлые кружки — зерна сефадекса: темные точки — молекулы белков разной молекулярной массы, толь­ко что внесенные в верхнюю часть колонки; Б — по мере продвижения проявителя по колонке (сверху вниз) осуществляется перенос молекул белков, однако только меньшие молекулы белков проникают внутрь зерен сефадекса; В — мелкие молекулы белков резко отстают от круп­ных его молекул, задерживаясь в зернах сефадекса. Первыми из колонки выйдут большие молекулы