Основы биохимии - Филиппович Ю. Б. 1999

Белки
Очистка белков

Белки, выделенные описанными способами, всегда содержат некоторое количество низкомолекулярных примесей, особенно ионов солей. Для полного освобождения от этих примесей белки подвергают дальнейшей очистке путем диализа, электродиализа, ультрафильтрации и перекристаллизации, гельфильтрации и другими способами.

Очистка белков методом диализа состоит в длительном, в течение несколь­ких суток, пропускании воды через сосуд, в который погружен диализационный мешочек. Его готовят из материалов, хорошо проницаемых для низ­комолекулярных соединений и ионов, но не пропускающих крупных молекул белка. Материалом для полупроницаемых мембран служит целлофан, размер пор которого можно изменять в широких пределах обработкой раствором ZnCl₂. Внутрь диализационного мешочка (камеры) помещают раствор белка. Камеру, как правило, снабжают капиллярной трубкой. В нее в первые часы диализа устремляется часть белкового раствора, объем которого возрастает вследствие поступления воды внутрь камеры (рис. 12.1).

Даже после длительной очистки белка путем диализа в нем остается некоторое количество ионов, сорбированных. белковыми частицами. Для полного удаления загрязняющих белок ионов используют метод электро­диализа: возле полупроницаемых мембран диализационной камеры помещают электроды, на которые подают напряжение, в результате чего остатки ионов поступают в омывающую мембраны воду и выносятся из аппарата (рис. 12.ІІ).

Рис. 12. Установки для очистки бел­ка путем диализа (І) и электроди­ализа (ІІ):

1 — трубка для подведения воды; 2 — корпус диализатора; 3 — диализационный мешочек; 4 — трубка для отвода воды и регулирования ее уровня; 5 — капиллярная трубка; А — диализационная камера; Б — корпус электродиализатора; а и а₁ — полупроницаемые мембраны; б и б₁ — электроды; стрелками указано направ­ление движения воды

Полупроницаемые мембраны высокой прочности из нецеллюлозных мате­риалов с калиброванными порами, через которые проходят низкомолекуляр­ные вещества, но не проникают высокомолекулярные белки, используют для очистки белков методом ультрафильтрации. Белковый раствор продавливают через такую мембрану сжатым газом или центробежной силой. Белок, оста­ющийся в процессе ультрафильтрации на мембране, не только очищается от низкомолекулярных соединений и ионов, но и концентрируется. Если подоб­рать такой размер пор в мембране, что через них будут проходить не очень крупные белки, а большие белковые молекулы будут задерживаться, то уль­трафильтрация может служить для фракционирования белков.

Долгое время считали, что белковые вещества существуют только в аморф­ном состоянии. Однако в 1906 г. наш соотечественник А. Д. Розенфельд впер­вые закристаллизовал оксидазу, выделенную из редьки, а в 1926 г. американ­ский ученый Д. Самнер получил другой кристаллический белок — фермент уреазу (от лат. urea — мочевина). Затем в течение последующих лет были получены в кристаллическом состоянии десятки белков.

В настоящее время доказано, что любой белок может существовать в кристал­лической форме. В основе различных приемов кристаллизации белка лежит принцип очень медленного приближения к той критической точке, в которой белок из растворенного состояния переходит в осадок. В этом случае белковые молекулы успевают закономерным путем объединиться в надмолекулярные агрегаты и дают кристаллические структуры. Практически такое медленное осаждение белков достигается путем введения соли через полупроницаемую мембрану или при медленном испарении воды из содержащего соль белкового раствора вплоть до точки высаливания. В последнее время получила распространение кристаллизация белков с использованием орга­нических соединений: 2-метил-2,4-пентадиола и полиэтилен­гликоля; с их помощью удалось закристаллизовать ряд белков, не поддававшихся этому тради­ционными методами.

Несколько видов белковых кристаллов приведено на рис. 13. Кристаллические бел­ки, особенно полученные в ре­зультате перекристаллизации, отличаются высокой степенью чистоты.

Хорошие результаты дает очистка белков от низкомо­лекулярных примесей при по­мощи гельфильтрации. Зерна сефадекса достаточно долго удер­живают низкомолекулярные ве­щества, и белковая фракция успевает за это время выйти из колонки в чистом виде. Фильт­рацию через гель сефадекса ши­роко используют для обессоли­вания белковых растворов.

Рис. 13. Виды белковых кристаллов: химотрипсина (А), пепсина (Б), белка дрожжей (В), рибонуклеази (І)