Основы биохимии - Филиппович Ю. Б. 1999
Белки
Оценка гомогенности белка
Вопрос о том, является ли полученный белковый препарат индивидуальным белком или смесью белков, имеет важнейшее значение. Так как белки выделяют из биологических объектов, содержащих тысячи и десятки тысяч индивидуальных белков (экспериментально в клетках эукариот доказано наличие более 1200 отдельных белков, но теоретически их число приближается к 10000), всегда можно ожидать, что в составе изолированного белка есть примесь других белков; это может привести к неправильным заключениям и выводам о свойствах исследуемого белка. Поэтому в белковой химии большое внимание уделяют оценке гомогенности, т. е. однородности белков.
Для этого предложено почти полтора десятка методов. Белок признают гомогенным, если увеличение его количества в твердой фазе не сопровождается возрастанием содержания белка в растворе (рис. 14). Наличие одной белковой полосы при электрофорезе в полиакриламидном геле, одного пика на выходной кривой (либо одной белковой зоны на пластинке) при хроматографировании или гельфильтрации, резкой границы пограничного слоя белок — растворитель при ультрацентрифугировании белка являются наиболее надежными показателями гомогенности белкового препарата. В большинстве случаев гомогенны кристаллические белки. Если кривая распределения белковых частиц по высоте при использовании метода свободной диффузии подчиняется теоретической кривой распределения Гаусса, белок гомогенен. Достижение в процессе очистки белка стабильного содержания свободных HS-групп или содержания радиоактивной метки (при работе с меченым белком), равно как и постоянного уровня биологической (ферментативной, гормональной и т. п.) активности, свидетельствует в пользу гомогенности белка. Выявление единственной N-концевой и единственной С-концевой аминокислоты при анализе белкового препарата также является признаком гомогенности выделенного белка.
Работами последних лет доказано, что каждый индивидуальный белок состоит из молекул только одного вида, строго одинаковой молекулярной массы, состава и строения. Поэтому столь важно получить гомогенный препарат белка.
Рис. 14. Оценка гомогенности белка по независимости растворимости от количества твердой фазы;
сплошной линией показан ход кривой в случае гомогенного белка, пунктиром — при наличии примеси