Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953

Альбумины, глобулины и другие растворимые белки
Фибриноген и фибрин

Свертывание крови обусловлено превращением растворимого белка плазмы фибриногена в нерастворимый белок фибрин. Изучению механизма этого процесса, одного из наиболее замечательных биологических процессов, было посвящено очень большое число исследований. Несмотря на это, вопрос до настоящего времени еще полностью не разрешен. Превращение фибриногена в фибрин вызывается действием особого фермента — тромбина. В плазме крови имеется предшественник тромбина — протромбин, который превращается в активный тромбин под влиянием тромбопластического вещества (тромбокиназы). Процесс свертывания крови состоит, таким образом, из двух фаз:

Протромбин является глобулином. При фракционировании кровяной сыворотки этиловым спиртом он находится во фракции ІІІ-2. Его можно очистить путем адсорбции на коллоидальном фосфорнокислом кальции [51], на гидроокиси алюминия [52] или гидроокиси магния [53]. Для извлечения протромбина из адсорбентов применяют фосфатный буфер (pH 8) или же прибегают к обработке гидроокиси магния углекислотой. Самые чистые препараты протромбина содержат 2 000—2 500 единиц на 1 мг белка [53].

Протромбин превращается в активный фермент тромбин под влиянием тромбопластина — вещества, присутствующего в кровяных пластинках, в легких, мозге и других органах. В качестве источника тромбопластина при клинических анализах крови на содержание в ней протромбина используется обычно мозг кролика. Тромбопластин содержится, повидимому, в клеточных гранулах, так как при скоростном центрифугировании он обнаруживается в осадке [54]. Тромбопластин представляет собой рыхло связанный комплекс белка с рибонуклеиновой кислотой и ацетальфосфатидом [55]. Этот комплекс может быть расщеплен на растворимый в воде белок и нерастворимый липоид. Хотя последний во многих отношениях подобен кефалину, однако при замещении его синтетическим кефалином процесс превращения протромбина в тромбин идти не может [55].

Механизм действия тромбопластина еще не совсем ясен. Большинство авторов считает, что тромбопластин является ферментом. В пользу этого говорит то, что трипсин также способен вызывать превращение протромбина в тромбин [56]. С этой точки зрения вполне оправдано старое название этого вещества — тромбокиназа [55]. С другой стороны, следует отметить, что тромбопластин и кальций реагируют с протромбином в стехиометрических отношениях и, следовательно, ведут себя в данном случае не так, как катализаторы [57]. Уже давно известно, что для свертывания крови необходимо наличие ионов кальция. Процесс свертывания крови можно предотвратить добавлением к крови солей щавелевой кислоты, солей лимонной кислоты или фтористого натрия, т. е. веществ, обладающих способностью связывать ионы кальция. Кальций из плазмы можно удалить также путем адсорбции его на амберлите IR100; если к такой плазме добавить соли кальция, то плазма вновь приобретает способность образовывать сгусток [58].

Большинство исследователей считает, что кальций необходим для первой фазы процесса свертывания, т. е. для образования из протромбина активного тромбина [59, 60]. Превращение фибриногена в фибрин происходит под влиянием тромбина и в отсутствие кальция. Роль ионов кальция или комплексов кальция [61] в первой фазе свертывания еще не вполне ясна. Можно предположить, что кальций либо активирует тромбопластин, либо угнетает действие определенного антипротромбина [62]. Кальций не нужен для свертывания змеиного яда; это подтверждается тем, что свертывание змеиного яда может происходить и в присутствии щавелевой кислоты [63].

Превращение протромбина в тромбин некоторые авторы рассматривают как аутокаталитический процесс, а именно: как цепную реакцию. Эта реакция начинается с образования тромбина из протромбина под влиянием тромбопластина и кальция и продолжается затем под катализирующим воздействием самого образовавшегося тромбина [60], подобно тому как это происходит в процессе превращения пепсиногена в пепсин (см. гл. XII). Физико-химические свойства тромбина сходны с физико-химическими свойствами протромбина. Тромбин экстрагируется из сгустка фибрина солевыми растворами и осаждается из сыворотки крови спиртом. Более чистые препараты тромбина получают при действии тромбопластина на протромбин в присутствии солей кальция [64]. Молекулярный вес тромбина равен примерно 77 000, молекулярный вес протромбина — 140 000; пока еще не установлено, дает ли одна молекула протромбина при своем превращении в активный фермент одну или две молекулы тромбина [50]. Сухие препараты чистого тромбина очень устойчивы и сохраняют свою активность при комнатной температуре в течение многих месяцев [50].

При действии тромбопластина на чистый препарат протромбина образование тромбина происходит очень медленно. Процесс, однако, можно значительно ускорить, если добавить еще один компонент, так называемый Ас-глобулин (от слова accelerator — ускоритель). Этот белок был недавно обнаружен в плазме крови; применяя различные методы адсорбции, удалось получить его в очищенном состоянии [65].

Из приведенных данных можно сделать заключение, что первая фаза свертывания — образование тромбина из протромбина — представляет собой очень сложный процесс, детали которого до настоящего времени еще недостаточно выяснены.

Вторая фаза свертывания крови — образование фибрина из фибриногена — также катализируется тромбином. Ни фибриноген, ни фибрин не обладают ферментативной активностью. Фибриноген по своим свойствам относится к группе глобулинов. Содержание фибриногена в плазме крови колеблется в пределах 0,2—0,4%. Фибриноген осаждается из плазмы при обработке ее низкими концентрациями этилового спирта или при прибавлении к плазме равного объема насыщенного раствора хлористого натрия [66, 67]. Молекулы фибриногена, растворы которого обладают высокой вязкостью, дают двойное лучепреломление в потоке и имеют форму вытянутых эллипсоидов [68]. Длина эллипсоида составляет примерно 700 Å, а отношение осей равно 18 : 1. Очень чистые препараты фибриногена можно получить из плазмы путем замораживания и последующего оттаивания [69].

Ферментативный характер процесса превращения фибриногена в фибрин в настоящее время не вызывает сомнения, однако сущность изменений, которые претерпевает при этом молекула фибриногена, остается до сих пор невыясненной. Есть основания полагать, что переход фибриногена в фибрин, подобно процессу денатурации нативного белка, заключается в развертывании пептидных цепей молекул фибриногена. При этом развертывании обнажаются положительные и отрицательные группы молекул фибриногена, которые, взаимодействуя между собой, образуют сеть из фибриновых молекул; отдельные цепи этой сети связаны солевыми мостиками [70]. В пользу этого взгляда говорит торможение образования сгустка фибрина всеми теми веществами, которые обладают способностью соединяться с положительно или отрицательно заряженными группами белковой молекулы; к такого рода веществам следует отнести гепарин и формальдегид, реагирующие с аминогруппами [70], а также основные краски, обладающие способностью присоединяться к кислотным группам фибриногена [71]. Вполне возможно, однако, что гепарин влияет на первую фазу процесса свертывания, играя роль антипротромбина. Если превращение фибриногена в фибрин действительно представляет собой процесс денатурации, то тромбин следует отнести к денатуразам [72], т. е. к ферментам, катализирующим разрыв слабых связей между отдельными пептидными цепями. В пользу той же гипотезы свидетельствует и то, что при действии тромбина на фибриноген в последнем освобождаются сульфгидрильные группы [73]. Надо, однако, указать, что такие вещества, как хлорртутные производные бензойной кислоты, которые избирательно реагируют с сульфгидрильными группами, не предотвращают свертывания фибриногена [50]. Гипотеза о том, что свертывание фибриногена связано с его денатурацией, до некоторой степени подкрепляется также торможением этого процесса при высоком давлении (порядка 800 атм) [74]. Высокое давление препятствует, как известно, образованию солевых мостиков между ионизированными группами, ибо этот процесс, сопровождающийся освобождением воды из гидратированных ионизированных групп, должен сопровождаться также и увеличением объема.

Если тромбин действует на фибриноген при pH 5,1, то не происходит никаких видимых изменений фибриногена. Фибриноген, однако, превращается при этом в так называемый профибрин, который при нейтральной реакции легко образует сгусток фибрина [75]. Эти данные также соответствуют предположению, что пептидная цепь фибриногена сперва развертывается, а затем подвергается полимеризации с образованием сетки из волокон фибрина.

Хорошо известно, что плазма крови при хранении в парафинированных сосудах долго не свертывается; если, однако, хранить ее в непарафинированных стеклянных сосудах, то она свернется очень быстро. Это явление свидетельствует о том, что соприкосновение с поверхностью стекла ускоряет свертывание. Аналогичную роль катализатора стеклянная поверхность играет при некоторых цепных реакциях. Естественно предположить, что и образование сгустка также протекает по типу цепных реакций. Превращение фибриногена в нерастворимый сгусток фибрина можно ускорить также добавлением небольших количеств нингидрина [76].

Электронная микрография фибринового сгустка показала, что фибриновые волокна имеют периодическую поперечную исчерченность, причем расстояния между отдельными полосами равны примерно 250 Å [77]. Четкообразная форма волокон фибрина дает основание предполагать, что они образуются путем продольной ассоциации глобулярных частичек и что процесс полимеризации, ведущий к превращению фибриногена в фибрин, заключается в соединении молекул фибриногена «конец с концом». Иначе трудно себе представить образование из небольших количеств фибриногена большого сгустка фибрина [78]. Вероятно, структурной единицей сгустка фибрина является ячейка из 10—14 молекул фибриногена, соединенных между собой своими концами по продольной оси. В первоначальном рыхлом сгустке фибрина имеется, вероятно, лишь небольшое число боковых поперечных связей.

Образование фибринового сгустка иногда сравнивают с образованием геля из белкового раствора. Однако консистенция и структура сгустка фибрина существенно отличаются от консистенций и структуры типичных гелей. Так, например, гель фибрина, содержащий только 0,2—0,4% фибрина, представляет собой гораздо более рыхлое образование, чем гель желатины; при взбивании сгустка фибрина стеклянной палочкой нити фибрина наматываются на палочку, вследствие чего сгусток резко уменьшается в объеме. Сгусток фибрина, который первоначально занимал объем, равный 100 мл, можно этим путем довести до объема в 1 мл. Это явление используется для количественного выделения и для определения фибриногена и фибрина в плазме крови. Легкость, с которой фибриновая сетка может сжиматься до небольшого объема, показывает, что волокна фибрина соединяются друг с другом своими боковыми поверхностями, как только они приходят в соприкосновение. Такое взаимное притяжение волокон фибрина приводит к образованию кристаллоподобных агрегатов из параллельных волокон (фиг. 35) [78, 79]. Природа связей, обусловливающих соединение молекул фибриногена «конец с концом», а также природа боковых поперечных связей между волокнами фибрина еще не выяснена. Несомненно, однако, что в образовании сгустка важную роль играют ионные связи. На это указывает способность сгустков фибрина прилипать к кристаллической решетке кремния на поверхности стекла, а также торможение свертывания плазмы при хранении ее в парафинированных сосудах. Возможно, что под действием тромбина освобождаются ионные группы. Правда, мы пока еще ничего определенного не знаем о характере этих ионных групп. Мы даже не можем сказать, возникают ли они при разрыве солевых мостиков, пептидных связей или при какой-либо другой реакции.

Фиг. 35. Сгусток фибрина [80].