Молекулярная биология: Структура и функции белков - Степанов В.М. 2005

Ферменты
Ингибирование ферментов

Ингибирование, т.е. полное или частичное подавление активности ферментов при сохранении их первичной и пространственной структуры, — один из важнейших путей регуляции биохимических процессов и в то же время продуктивный способ изучения биокатализа. Различают обратимые и необратимые ингибиторы.

К необратимым относят такие ингибиторы, которые инактивируют фермент, образуя с ним связь, достаточно устойчивую и практически не диссоциирующую в условиях, типичных для его действия. Обычно это ковалентная связь с одной из функциональных групп каталитического центра.

Заметим, что нередко удается подобрать такие условия, при которых инактивирующая группировка отщепляется и фермент реактивируется, однако поскольку эти условия принципиально отличны от тех, при которых происходило ингибирование, последнее все же считается необратимым.

Для примера рассмотрим ингибирование протеолитического фермента папаина, имеющего в каталитическом центре тиоловую группу цистеина, соединениями ртути. Реакция иона двухвалентной ртути с этой тиоловой группой приводит к образованию труднодиссоциирующего меркаптида:

Фермент утрачивает в результате этой реакции активность, и ингибирование в данных условиях необратимо. Однако в присутствии избытка других тиоловых соединений, например меркаптоэтанола, происходит перераспределение ионов ртути между ними и цистеином в активном центре папаина, вследствие чего последний высвобождается и папаин полностью восстанавливает свою активность:

Такую последовательность превращений используют на практике как способ хранения папаина, предотвращающий его саморасщепление, автолиз. Тем не менее ингибирование папаина ионами ртути рассматривают как необратимое.

С возможностью действия необратимых ингибиторов следует считаться, в частности, при выделении ферментов. Так, ионы ртути свинца, меди и ряда других тяжелых металлов, блокируя сульфгидрильные группы некоторых ферментов, могут их инактивировать, что требует тщательного их удаления из растворов, а иногда применения комплексонов.

Среди необратимых ингибиторов выделяются специфические реагенты на функциональные группы каталитического центра ферментов. Избирательность их действия повышается, если они содержат структуры, способствующие их связыванию в активном цент ре или, что еще эффективнее, воспроизводят строение переходного фермент-субстратного комплекса. Например, при действии диизопропилфторфосфата на трипсин или другие сериновые протеиназы ингибитор ацилирует активную гидроксильную группу серина в активном центре фермента, однако образующееся соединение, будучи структурным аналогом переходного состояния, устойчиво к дальнейшему гидролизу, поэтому фермент не может регенерироваться и оказывается необратимо ингибированным. Диизопропилфторфосфат необратимо ингибирует также холинэстеразы, что делает его сильным ядом.

Необратимое ингибирование встречается и в природе. Именно так пенициллины инактивируют D,D-карбоксипептидазу — фермент, вовлеченный в биосинтез муреина — полимера, который входит в структуру стенок бактериальных клеток. Пенициллины, в известной мере имитирующие строение субстрата этого фермента, связываются с ним и ацилируют с раскрытием ß-лактамного цикла гидроксильную группу серина в активном центре фермента, что вызывает его необратимое ингибирование.

Взаимодействие обратимых ингибиторов с ферментом по схеме

описывается константой ингибирования К_i, которая представляет собой константу диссоциации комплекса фермент-ингибитор ЕI:

Очевидно, что K_i численно равна концентрации ингибитора, при которой половина молекул фермента оказывается связанной в комплекс фермент-ингибитор.

Обратимые ингибиторы в свою очередь подразделяют на конкурентные и неконкурентные. К конкурентным относятся ингибиторы, взаимодействующие с той же зоной поверхности фермента, которая связывает субстрат, а следовательно, способные конкурировать с ним за фермент. Впрочем, участки связывания субстрата и конкурентного ингибитора вовсе не обязательно совпадают — для конкурентных отношений достаточно их частичного перекрывания. Ввиду этого ингибитор химически может быть и не похож на субстрат, поскольку зоны связывания нередко поливалентны. Так, индол и ß-нафтол конкурентно ингибируют протеиназу а-химотрипсин, хотя в них трудно усмотреть какую-либо аналогию с пептидами. Речь, видимо, идет об использовании в обоих случаях одного и того же гидрофобного участка химотрипсина.

Уравнение скорости ферментативной реакции в присутствии конкурентного ингибитора несколько сложнее уравнения Михаэлиса—Ментен:

Введение «кажущейся» константы Михаэлиса К'_m = К_m(1 + [I]/ [K_i]) приводит уравнение к канонической форме уравнения Михаэлиса-Ментен. Таким образом, присутствие в системе конкурентного ингибитора эквивалентно увеличению константы Михаэлиса, причем степень этого увеличения определяется величиной отношения концентрации ингибитора к константе ингибирования, т.е. к параметру, характеризующему прочность взаимодействия данного ингибитора с ферментом.

Понятно, что максимальная скорость и соответствующая константа k_кат характеризуют скорость превращения в продукт уже образовавшегося фермент-субстратного комплекса, поэтому на них присутствие конкурентного ингибитора повлиять не может. Изменение же кажущейся константы Михаэлиса учитывает снижение эффективной концентрации фермента, поскольку комплекс фермент—конкурентный ингибитор с субстратом не взаимодействует:

Конкурентное ингибирование распространено в природе; его используют в практических целях для регулирования активности ферментов. По этому механизму действуют, например, природные ингибиторы протеиназ и амилаз, комплементарность которых соответствующим активным центрам так велика и связывание столь сильно, что их действие нередко выглядит как практически необратимое ингибирование из-за очень малых величин констант диссоциации комплексов фермент-ингибитор. Многие лекарственные препараты, нацеленные на подавление нежелательной активности фермента, конструируются как конкурентные ингибиторы, причем подбираются такие их структуры, которые максимально соответствуют строению зоны связывания фермента, чтобы понизить К_i. Так, аналоги субстратов ренина — протеиназы, вовлеченной в регуляцию давления крови, — которые вместо расщепляемой ферментом пептидной связи — СО—NH— содержат устойчивую к гидролизу структуру, например —СО—СН₂—, имеют К_i порядка 1 ∙ 10^-9 М и могут иметь терапевтическое значение.

Неконкурентное ингибирование принципиально отличается от конкурентного: в этом случае ингибитор не затрагивает зону связывания субстрата, а присоединяется к ферменту по иному пути, вызывая инактивацию каталитического центра. Поскольку ингибитор и субстрат связываются в таком случае различными участками фермента, ингибитор может присоединяться как к свободному ферменту, так и к фермент-субстратному комплексу, в обоих случаях инактивируя фермент. Именно независимость зон связывания делает невозможной конкуренцию между субстратом и ферментом; следовательно, неконкурентное ингибирование не может быть снято избытком субстрата.

Итак, для неконкурентного ингибирования справедлива следующая схема:

Уравнение скорости ферментной реакции в присутствии неконкурентного ингибитора выглядит следующим образом:

Как уже говорилось, характер связывания субстрата ферментом в присутствии неконкурентного ингибитора не изменяется, отсюда и сохранение К_m. Напротив, величина V_mах корректируется множителем К_i/([I] + K_i), величина которого тем меньше, чем больше концентрация ингибитора по сравнению с константой ингибирования. Здесь снова концентрация действующего вещества, в данном случае ингибитора, сравнивается с характерной для него константой ингибирования. Уменьшение эффективной максимальной скорости соответствует снижению активности каталитического центра при связывании неконкурентного ингибитора.

Неконкурентное ингибирование может быть следствием нескольких способов взаимодействия фермента и ингибитора. Возможно, ингибитор, связывающийся с функциональными группами каталитического центра, настолько мал, что не мешает связыванию субстрата. Так, например, могут вести себя ионы водорода, протонирующие функциональные группы, которые участвуют в катализе.

Ингибитор может связываться на участке, примыкающем к каталитическому центру, и перекрывать последний, практически не затрагивая зоны связывания субстрата. Такие ситуации особенно вероятны для ферментов с несколькими субстратами, которые связываются каждый на своем участке. Наконец, возможно, в особенности для ферментов сложной структуры, что присоединение ингибитора к участку, отдаленному от каталитического центра, вызовет такие изменения в структуре фермента, которые передадутся в активный центр и нарушат его строение, приводящее к инактивации фермента. Это частный случай аллостерического ингибирования ферментов — весьма распространенного механизма регуляции их активности.

Принципы функционирования, общие для всех ферментов, реализуются в каждом случае в свойственный данному ферменту способ связывания субстрата и каталитический механизм. Если связывание субстратов и обусловленная им специфичность ферментов достаточно подробно описаны в последние годы, то способ действия каталитического центра практически ни в одном случае не может считаться окончательно установленным, хотя для ряда ферментов предложены механизмы, весьма близкие к реально существующим. Мы рассмотрим данные о механизме функционирования некоторых ферментов, уделяя особое внимание чертам, имеющим общее значение и типичным для биологических катализаторов различной природы.