Молекулярная биология: Структура и функции белков - Степанов В.М. 2005

Ферменты
Сериновые протеиназы

Сериновые протеиназы, названные так по аминокислотному остатку, характерному для их активных центров, широко распространены в природе и вместе с протеолитическими ферментами других классов (аспартилъными, цистеиновыми и металлопротеиназами) обеспечивают глубокое расщепление белков — основу их катаболизма — и целый ряд реакций ограниченного протеолиза, имеющих регуляторное значение. Известно несколько семейств, объединяющих эволюционно родственные сериновые протеиназы. Для животного мира очень характерны многообразные сериновые протеиназы, принадлежащие к семейству химотрипсина, т.е сходные с химотрипсином (наиболее изученным ферментом этого типа) по пространственной структуре, строению и механизму действия каталитического центра. К этому же семейству относятся некоторые сериновые протеиназы стрептомицетов. Сериновые протеиназы другого семейства — субтилизины — особенно характерны для прокариот, но встречаются также в растениях и животных. Известно и третье семейство — сериновые карбоксипептидазы, продуцируемые животными, грибами, дрожжами и растениями. Однотипность строения каталитических центров и глубокое сходство механизмов действия ферментов этих семейств, совершенно не похожих друг на друга по пространственной структуре, объясняются, по-видимому, конвергентной эволюцией белков-предшественников.

В дальнейшем изложении обобщены данные о механизме действия сериновых протеиназ.

10.5.1. Связывание субстрата

Зона связывания субстрата в протеиназах, участвующая в образовании комплексов с белками или их фрагментами, достаточно протяженна. Обычно с ней могут взаимодействовать 5-8 аминокислотных остатков — по 2 4 по обе стороны расщепляемой пептидной связи. Наблюдать связывание истинных субстратов — пептидов значительной длины — методами рентгеноструктурного анализа не удается из-за чрезвычайно малых времен существования таких комплексов, в которых субстрат быстро расщепляется. Ввиду этого исследуют комплексы ферментов с аналогами субстратов. Так, подробно описано взаимодействие альдегидопептидов (соединений, в которых С-концевой остаток заменен аминоальдегидом) с ферментом семейства химотрипсина — протеиназой А стрептомицетов:

При взаимодействии с сериновой протеиназой альдегидная группа образует полуацеталь с гидроксилом серина активного центра. Эта связь служит моделью переходного фермент-субстратного комплекса, получающегося при взаимодействии с гидроксильной группой остатка серина в активном центре и карбонила расщепляемой пептидной связи:

Образующийся весьма стабильный комплекс позволяет описать систему взаимодействий между ферментом и субстратом на участке, предшествующем атакуемой пептидной связи. Взаимодействия фермента и С-концевой части субстрата изучали на других моделях, в частности на комплексах ферментов и природных белковых ингибиторов протеиназ.

На участке, предшествующем атакуемой пептидной связи, фермент формирует с субстратом своего рода антипараллельную ß-структуру, образуя три водородные связи. Их дополняют еще четыре водородные связи с функциональными группами каталитического центра. Укладывание пептидного субстрата в зоне связывания сопровождается небольшим смещением окружающих ее участков фермента, а также отщеплением цепочки молекул воды, которые гидратировали функциональные группы свободного фермента, образуя с ними водородные связи.

Система водородных связей между субстратом и ферментом дополняется рядом гидрофобных контактов. Важнейшие из них образует боковая цепь того аминокислотного остатка, карбонильная группа которого принадлежит атакуемой ферментом пептидной связи. Согласно принятой номенклатуре, такой аминокислотный остаток обозначают Р₁, предшествующий ему — Р₂, далее Р₃, Р₄ и т.д., следуя к аминоконцевому остатку субстрата. Остаток, чья аминогруппа образует атакуемую связь, обозначают Р'₁ следующий — Р'₂и т.д Соответствующие этим остаткам участки зоны связывания субстрата обозначают S₄, S₃, S₂, S₁, S'₁, S'₂.

Протеиназа А стрептомицетов, гидролизующая пептидные связи, в которых участвует карбоксильная группа гидрофобных аминокислот, т.е. близкая по специфичности к химотрипсину, образует с боковой цепью остатка Р₁ около 40 нековалентиых контактов. Связывание этой гидрофобной группы сопровождается вытеснением молекул воды из гидрофобной впадины S₁. Столь развитая система нековалентных контактов придает особо важное значение остатку Р₁, природа которого в основном определяет выбор расщепляемой пептидной связи сериновыми протеиназами, иными словами, специфичность этих ферментов, хотя последняя зависит (пусть в меньшей степени) и от соседних аминокислотных остатков.

Интересно, что в образовании гидрофобных контактов с субстратом участвуют остатки аланина, глицина, треонина, глутамина, пролина, выстилающие зону S₁ фермента. На первый взгляд участие этих, в большинстве своем гидрофильных, аминокислот в построении гидрофобной зоны связывания парадоксально, однако в этом сказывается принципиальная разница в поведении одних и тех же остатков в растворе и при включении в фиксированную пространственную структуру белка. В последней даже метиленовая группа глицина, будучи как бы отделенной, изолированной от гидрофильных пептидных связей, способна вести себя как гидрофобный элемент. Такие небольшие сами по себе элементы, закрепленные в пространстве водородными связями соседних групп, образуют своего рода гидрофобную мозаику, выстилающую впадину, «карман» в зоне связывания субстрата.

Видимо, такой способ формирования гидрофобных зон даже эффективнее, чем использование для этой цели отчетливо гидрофобных аминокислот с крупными боковыми группами, поскольку зафиксировать последние в поверхностной структуре белка, в частности лишить их способности вращаться, сложнее, чем фиксировать маленький гидрофобный элемент.

У сериновых, протеиназ, специфически расщепляющих пептидные связи, которые образованы карбоксильными группами лизина или аргинина — трипсина и его аналогов, — также реализуются множественные контакты между полипептидной цепью субстрата и ферментом. И в этом случае особенно важно установление системы водородных связей между пептидной цепью субстрата и ферментом:

Связывание остатка Р₁ в основном определяется электростатическими взаимодействиями между катионными группами в боковой цепи субстрата — NH⁺₃ в случае лизина или гуанидиниевой группой

в случае аргинина — и карбоксилат-анионом остатка аспарагиновой кислоты, расположенного на дне гидрофобной впадины S₁ (Asp-189 в трипсине) (рис. 10.3). Такому электростатическому взаимодействию благоприятствует изоляция ионной пары от контакта с водой.

Рис. 10.3. Размещение боковой цепи остатка P₁ субстрата в зоне S₁ трипсина.

А — взаимодействия NH’₃-группы лизина, Б - гуанидогруппы аргинина. Светлыми кружками обозначены атомы кислорода, темными — азота, W — молекулы воды, удерживаемые ферментом; пунктиром показаны водородные связи, цифры соответствуют их размерам в ангстремах

Кроме того, оно дополняется системой водородных связей между гуанидо- или аминогруппой субстрата и карбоксилат-ионом Asp-189, а также кислородными атомами ряда С=O-групп фермента. Замена остатка Asp-189 на остаток лизина в трипсине, проведенная методами белковой инженерии, радикально изменила специфичность фермента, который перестал гидролизовать пептидные связи аргинина и лизина, но приобрел (правда, слабую) способность расщеплять связи, образованные гидрофобными остатками фенилаланина, лейцина, тирозина, т.е. по специфичности стал близким другому ферменту того же семейства — химотрипсину.

Иногда остаток Р₁ не столь доминирует в определении специфичности, и больший вес приобретают взаимодействия с ферментом других аминокислотных остатков субстрата. Например, специфичность калликреина — аналога трипсина, вовлеченного в регуляторные механизмы у животных, — определяется присутствием аргинина в положении P₁ и гидрофобного остатка в положении P₂ субстрата и оказывается, таким образом, гораздо более узкой.

При действии протеиназ на нативные белковые субстраты специфичность гидролиза определяется не только и даже не столько последовательностью аминокислот расщепляемого участка, сколько его пространственной, стерической доступностью. Так, погружение всего активного центра калликреина в своего рода впадину за счет удлинения прилегающих к нему пептидных петель фермента делает практически невозможным гидролиз обычных белковых субстратов, даже если они содержат последовательность гидрофобный остаток — аргинин. Калликреин атакует только такой белок, в котором соответствующая его специфичности последовательность расположена на выступе белка-субстрата, комплементарном впадине активного центра фермента. Так достигается очень узкая, практически уникальная специфичность калликреина — фермента, участвующего в отщеплении вазоактивных пептидов от белковых предшественников, но практически не действующего на другие белки.

Отметим еще одну особенность связывания белковых субстратов в активном центре протеиназ. При образовании комплексов с достаточно длинными пептидами, перекрывающими активный центр, укладка полипептидной цепи в зоне связывания требует, как предполагают, определенного ее «перекручивания», некоторого искажения плоскостной структуры атакуемой ферментом пептидной связи, что создает благоприятные условия для ее перехода из плоской в пирамидальную конфигурацию, близкую к переходному состоянию. Следовательно, уже на стадии образования комплекса Михаэлиса при связывании субстрата подготавливается стереохимический переход, имеющий ключевое значение для эффективного катализа.

Характерные для сериновых протеиназ черты связывания субстрата — множественность взаимодействий, точность ориентации относительно групп каталитического центра и преимущественное связывание конформации, стереохимически: приближенной к той, которая существует в переходном комплексе, — типичны для многих ферментов. Необходимо подчеркнуть, что две важнейшие стадии катализа — связывание субстрата и собственно каталитическое превращение — хотя и рассматриваются раздельно, в действительности слиты в единый механизм.

10.5.2. Каталитический механизм

Топография каталитического центра сериновых протеиназ описана достаточно подробно. Изучение структуры комплексов ферментов этого класса с различными аналогами субстратов и ингибиторами в сочетании с данными по кинетике катализа, химической модификации отдельных групп фермента, метода ЯМР и белковой инженерии привели к следующим представлениям о механизме действия сериновых протеиназ.

В превращении субстратов наибольшая роль принадлежит гидроксильной группе серина Ser-195 (здесь и далее нумерация остатков дается по последовательности наиболее изученного фермента — а-химотрипсина), имидазолу His-57, ß-карбоксильной группе Asp-102, а также пептидным группам остатков Ser-195 и Gly-193. Таким образом, в сериновых протеиназах, как и в других ферментах, активный центр собран из аминокислотных остатков, расположенных в совершенно разных участках полипептидной цепи, но сближенных в пространственной структуре фермента (рис. 10.4).

Рис. 10.4. Расположение функциональных групп в каталитическом центре сериновых протеиназ.

Показаны компоненты каталитического центра — остатки серина, гистидина и аспарагиновой кислоты; зачернены атомы азота и кислорода, участвующие в механизме катализа. Прерывистыми линиями обозначены водородные связи. Нумерация дана по аминокислотной последовательности химотрипсина; в других сериновых протеиназах эти аминокислоты могут занимать другие места в первичной структуре фермента, но их относительное расположение в пространстве строго сохраняется

Как правило, компоненты каталитического центра взаимодействуют с соседними группами фермента, что закрепляет их в определенной ориентации и видоизменяет химические характеристики.Например, карбоксильная группа остатка Asp-102 образует с соседями четыре водородные связи, которые стабилизируют ее анионную форму и как следствие смещают рК_а этого остатка к 2-3 вместо 3,6 (величине, характерной для обычной ß-карбоксильной группы аспарагиновой кислоты). Соседство этого карбоксилат-иона стабилизирует протон на одном из атомов имидазольной группы гистидина — именно на том, который обращен к Asp-102, — и вместе с тем определенную электронную структуру имидазольного кольца His-57. Последнее очень характерно для функциональных групп белка и не имеет аналогий в поведении таких же групп, в частности имидазольной, в небольших молекулах. Окружение функциональных групп в белке анизотропно.

Влияние микроокружения на поведение функциональных групп в ферменте весьма существенно, и все же реакционная способность компонентов активного центра сериновых протеиназ в отсутствие субстрата не обнаруживает резких различий, которые выходили бы за рамки обычных вариаций в химических свойствах функциональных групп на поверхности белка. Так, сообщения о том, что имидазол His-57 и карбоксил Asp-102 в активном центре белка как бы поменялись свойствами, причем имидазол оказался более кислым, чем карбоксильная группа, оказались ошибочными. Точно так же нельзя думать, что в свободном ферменте происходит эстафетный перенос отрицательного заряда от карбоксилат-иона Asp-102 на Ser-195 и гидроксил последнего превращается в гидроксидный ион — чрезвычайно сильный нуклеофил. Такая передача заряда была бы сразу же обесценена реакцией гидроксид-иона с водой:

Напротив, в фермент-субстратном комплексе химические свойства участников каталитического процесса, в том числе функциональных групп каталитического центра, меняются очень существенно, что определяется не только развитой системой нековалентных взаимодействий, охватывающей фермент-субстратный комплекс, но и изоляцией всей системы от воды. По справедливому замечанию М. Дьюара, само связывание фермента и субстрата предполагает как необходимую предпосылку отделение молекул воды, окружающих до реакции субстрат и заполняющих зону активного центра фермента. Вследствие этого каталитическая реакция переносится в совершенно иную среду. Это соображение еще раз подчеркивает неразрывную связь обеих сторон биокаталитического процесса — связывания и собственно превращения субстрата.

Гипотетический механизм действия сериновых протеиназ может быть описан следующим образом (рис. 10.5). Необходимо учитывать, что происходящие последовательно процессы в действительности могут протекать синхронно.

Связывание полипептидного субстрата в активном центре ставит карбонильную группу атакуемой пептидной связи в такую позицию, что ее кислород оказывается в так называемой оксианионной впадине. Образование этим атомом двух водородных связей с соответствующим образом ориентированными N—Н-группами, принадлежащими пептидным связям остатков Ser-195 и Gly-193, способствует поляризации связи С=O и ее переходу в С—О, стабилизирует оксианион. Положительный заряд на углероде карбонильной группы за счет точного связывания субстрата ферментом пространственно сближен с кислородом гидроксильной группы серина. Это вызывает поляризацию гидроксильной группы, которая принимает структуру близкую к —СН₂—О^- ... Н⁺, что резко усиливает нуклеофильность атома кислорода серина.

Рис. 10.5. Механизм действия сериновых протеиназ.

А — функциональные группы в активном центре фермента. В левой полусфере — имидазол гистидина, за которым расположен карбоксил остатка аспарагиновой кислоты, фиксированный системой водородных связей, в правой — боковая цепь серина и две водородные связи оксианионной впадины.

Б — в правой полусфере — продукт взаимодействия субстрата (показан тирозин в положении Р₁); кислород размещен в оксианионной впадине; протон, покинувший кислород гидроксильной группы серина, перемещается к азоту имидазола и далее — к атому азота расщепляемой

пептидной связи.

В — молекула воды разместилась вблизи атома углерода карбонильной группы, причем ее протон переместился к азоту имидазола гистидина.

Г— гидроксильная группа воды присоединилась к углероду карбонильной группы, чем завершилось расщепление пептидной группы

Таким образом, в рассматриваемой схеме увеличение нуклеофильности серина происходит под влиянием соответственно ориентированного и поляризованного за счет взаимодействия с ферментом карбонила субстрата, причем последний экранирует нуклеофил, защищая его от воды.

Далее образуется ковалентная связь между углеродом субстрата и кислородом субстрата, вероятно, более длинная и менее прочная, чем обычно (рис. 10.5, Б):

Протон, отщепившийся от гидроксила серина, перемещается по траектории, которая задана имидазольной группой His-57, приближаясь к непротонированному атому азота, а затем переходит к —NH-группе расщеплямой пептидной связи. Как известно, атом азота в пептидных группах практически лишен основных свойств из-за смещения свободной электронной пары, обслуживающей связь С—N, которая носит характер частично двойной. Однако после поляризации карбонильной группы в оксианионной впадине плоскостной характер пептидной связи утрачивается, связь С—N становится простой и атом азота приобретает свойства весьма сильного основания. Ввиду этого протон от имидазольной группы — слабого основания — переходит к группе — NH^-, описав своего рода дугу. Связь С—N разрывается и фрагмент пептидного субстрата высвобождается (рис. 10.5, В).

Таким образом, выполнена первая задача катализа — расщеплена пептидная связь и высвобожден С-концевой фрагмент пептида. Оставшаяся часть пептида (от остатка P₁ до аминного конца) пока сохраняет связь с ферментом через остаток серина. По-видимому, эта связь может в определенных условиях стабилизироваться за счет восстановления карбонильной группы, взаимной компенсации положительного и отрицательного зарядов, так что фрагмент пептида образует с ферментом сложноэфирную связь — образуется так называемый ацилфермент:

При действии сериновых протеиназ на некоторые аналоги субстратов удается наблюдать, а иногда и выделить достаточно устойчивый ацилфермент. При гидролизе обычных субстратов, однако, такая стабилизация, видимо, не обязательна, и гидролизу подвергается производное с поляризованной карбонильной группой. Во всяком случае, после ухода С-концевого фрагмента пептида молекула воды занимает освободившееся место и располагается так, что образует водородную связь с азотом имидазольной группы, тогда как ее атом кислорода оказывается сближенным с положительно заряженным атомом углерода карбонильной группы. Это приводит к отщеплению протона, присоединяющегося к имидазолу, и образованию гидроксильного иона, легко взаимодействующего с положительно заряженным углеродом карбонила. Протон мигрирует к кислороду серина, в результате чего с расщеплением связи С—О восстанавливается гидроксильная группа активного центра и высвобождается N-концевой фрагмент пептида, чем и завершается каталитический цикл (рис. 10.5, Г):

Эта стадия реакции протекает в целом аналогично первой, однако роль гидроксильной группы серина переходит к молекуле воды.

Если принять, что происходит стабилизация промежуточного продукта и образуется ацилфермент, механизм гидролиза последнего окажется практически таким же. Следует лишь предположить поляризацию С = О-связи в сложноэфирной группе ацилфермента за счет водородных: связей в оксианионной впадине, что приведет к появлению положительного заряда на атоме углерода карбонильной группы, т.е. к образованию того же самого промежуточного продукта, судьба которого прослежена выше.

Важнейшей чертой рассмотренного механизма действия сериновых протеиназ, по-видимому типичной и для других ферментов, является стабилизация тетраэдрического переходного состояния в фермент-субстратном комплексе. Характерно, что весьма эффективными ингибиторами сериновых протеиназ являются алкилборные кислоты, в которых предсуществует тетраэдрическая конфигурация заместителей — трех гидроксильных групп и алкильного остатка, — имитирующая структуру переходного состояния. Особенно эффективны производные боронатного аналога фенилаланина, который связывается в участке S₁ за счет бензильной группы и в каталитическом центре; соответствующая константа ингибирования K_i составляет 10^-8 М:

Альдегидопептиды — ингибиторы сериновых протеиназ, как упоминалось, образуют с серином активного центра ковалентную полуацетальную связь — структуру, аналогичную в известной мере ацилферменту. При этом свободный гидроксил связывается в оксианионной впадине так же, как это происходит с кислородом карбонильной группы в фермент-субстратном комплексе.

Хорошо известны ингибиторы сериновых протеиназ, которые при взаимодействии с ферментом проходят первую фазу каталитического процесса и образуют ацилфермент. Некоторые такие производные гидролизуются с измеримой скоростью, однако другие, в частности производные арилсульфофторидов и ряд фосфорорганических соединений, оказываются стабильными, что приводит к необратимому ингибированию фермента. Ниже показаны структуры стабильных ацилферментов, получающихся при ингибировании сериновых протеиназ фенилметилсульфонилфторидом (слева) и диизопропилфторфосфатом (справа):

Изложенные выше представления о механизме действия сериновых протеиназ подтверждены методами белковой инженерии. Замена серина активного центра в ряде ферментов этого семейства (при помощи сайт-специфичного мутагенеза) на аланин неизменно приводит к практически полной утрате активности. Замена компонентов каталитического центра в субтилизине (протеиназе бацилл) дала следующие результаты. Замена серина Ser-221 (остатка, соответствующего Ser-195 в химотрипсине) аланином снижала активность фермента примерно в 10⁶ раз, причем практически весь эффект приходился на снижение каталитической константы k_кат, а константа Михаэлиса сохраняла свое значение. Такие же результаты давала замена гистидина каталитического центра аланином. Несколько меньшим, но все же очень значительным было падение k_кат при замене Asp-32 аланином, k_кат в этом случае составляла 4∙10^-6 от величины, характеризующей исходный фермент.

Таким образом, все компоненты «триады» каталитического центра критически важны для эффективного катализа. Роль остатка аспарагиновой кислоты, которая может показаться менее значимой с учетом приведенного выше механизма, видимо, состоит в том, что карбоксилат-анион этого остатка, во-первых, фиксирует в пространстве имидазольное кольцо гистидина каталитического центра и, во-вторых, обеспечивает закрепление приведенного выше на схемах таугомерного состояния имидазольной группы.

Труднее анализировать этим методом роль N—Н-групп, образующих оксианионную впадину, так как в химотрипсине и гомологичных ему ферментах обе они принадлежат пептидному скелету. Однако в субтилизине роль одного из компонентов оксианионной впадины выполняет амидная группа аспарагина. Замена этого остатка лейцином снижает эффективность поляризующего действия оксианионной впадины на С = О-группировку субстрата, вследствие чего активность снижается примерно в 10³ раз, сохраняя тем не менее вполне заметный уровень